蛋白质组学技术服务

2D电泳及质谱鉴定技术服务

----生工带您走进蛋白质组学时代

✧实验原理：

1、双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。成功的二维电泳可以将

2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（ImageMaster等）进行图谱差异分析，找到差别点。然后把差异点切出，进行脱色、酶解。最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。通过搜库可得到差异蛋白质的详细信息。

2、ABI 4800 串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS）是目前对SDS-PAGE胶上的蛋白条带和2D胶上差异点蛋白，切取并经过酶

解后进行鉴定最常用的质谱，它在肽指纹图谱(一级质谱)的基础上选择强度最大的10个峰进行进行二级质谱，对肽段碎片的分子量精确测定，再将一级和二级质谱数据整合并使用GPS 3.6（Applied Biosystems）和Mascot2.1(Matrix Science)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定。其提供的专一性信息丰富，对于数据库的检索，特别是对数据量丰富、冗余信息多的数据库的检索，其鉴定结果比肽指纹图谱可靠的多，该ABI 4800也可以不经过酶解直接对蛋白进行分子量精确测定。

经典蛋白质组学研究策略

✧主要步骤：

1、样品制备（蛋白提取）：主要包括植物、动物细胞或组织等的破碎、离心以及定量。

2、第一向IEF等电聚焦实验。

3、第二向SDS-PAGE实验。

4、硝酸银染色或考马斯亮蓝染色。

5、图像分析及数据处理。

6、提供双向电泳的正式实验报告。

7、选取感兴趣的蛋白点进行酶解。

8、对酶解后蛋白进行质谱技术分析（Maldi-Tof-Tof/MS）。

9、提供质谱的正式实验报告。

✧所需仪器：

IPG-PhorIII GE Ruby SE600Image Scanner Maldi-T of-T of

✧实例分析：

内皮细胞诱导前后蛋白变化量及差异蛋白分析

✧提供结果：

✓蛋白定量信息一份

✓预实验报告一份

✓胶图扫描结果图片（预实验+正式试验）

✓Image Master软件分析报告（差异点列表、差异点对应位置图、组内差异点强度柱状图及组内差异点强度列表）✓正实验报告一份

✓Maldi-Tof-Tof/MS鉴定报告（成功率、库信息、蛋白查库结果等）

✧样品要求：

3、样品需为可溶的固体蛋白或液体蛋白溶液，建议液体蛋白溶解体系为8M尿素/4％CHAPS/40mM Tris/65mM DTT。如溶

解于其它缓冲液体系中，请应提供缓冲液成分。

4、单次硝酸银染色提供蛋白量不小于0.3mg；单次考马斯亮蓝染色提供蛋白量不小于1mg；总蛋白量不小于2mg。

5、用于一次制备型样品，动物组织或菌体的新鲜样本始终不小于500mg；收集细胞数量不小于1×108；植物或真菌样品

湿重不小于2g；

6、为避免蛋白样品降解，客户所寄的蛋白样本最好为冻干品，若为溶液蛋白，则需低温保存，血液血浆样品应贮于4℃

保存，其它液体蛋白溶液贮于-20℃保存。（外地客户如需进行样品邮递请使用干冰）

7、如样品中含有杂质例如核酸、脂类、多糖、色素类等或需其它特殊要求例如浓缩、透析等请提前告知。我们将根据具

体情况对实验方案做出相应调整。

服务价格：

常见问题分析：

1．等电聚焦为什么电压上不去？

主要是提取的蛋白样品中离子含量过高，通过适当修改蛋白提取方法比如采用除盐试剂盒、滤膜过滤或者丙酮沉淀等方法可以获得较好的效果。

2．双向电泳图谱的横条纹与等电聚焦有什么关系？

等电聚焦不完全或者聚焦过度都会引起双向电泳图谱中横条纹的产生，不同的是等电聚焦不完全导致的横条纹较模糊且较粗，而等电聚焦过度形成的横条纹则较为清晰和细小。合适的等电聚焦时间的设置需要根据胶条长度、PH范围以及上样量等因素综合考虑。

3．质谱鉴定取胶点该如何取？有什么注意事项？

取点时将0.2ml的枪头前端剪去一段，用该枪头将凝胶戳取下来并转移至0.5ml离心管中，用水将胶粒反复吸打冲洗两至三次，最后吸干离心管中所有水分后封盖保存并做好标记。离心管最好用进口离心管；水最好用去离子水；取点时最好带上口罩与手套，以免角蛋白污染。针对特别小的蛋白点，枪头孔径可能会比蛋白点面积大，取点时把该蛋白点的边上空白部分也一起取一些下来也不要紧，只有胶图上清晰可见的蛋白点，其含量就足够用于质谱鉴定，所以只要取一次蛋白点就可以了，不需要把几张胶上的蛋白点取了放在一起进行鉴定，同时注意不要把胶点弄得太碎，条件允许的话可以多取一次胶点的重复以做好备份。

4．蛋白凝胶是否可以长期保存？对质谱鉴定有何影响？

如果保存时间超过一个月，可以放入-20℃或者-80℃冰箱，如果小于一个月，则可以常温保持，基本不会影响后续质谱鉴定效果。

5．凝胶扫描以及图像分析的基本要素是什么？

染色后的凝胶用ImageScanner 扫描仪进行扫描，扫描模式为灰度模式，光密度值为300dpi。使用ImageMaster 2D 6.0 软件对图像进行分析，主要操作包括凝胶蛋白点检测、图像背景扣除、蛋白点灰度值标准化、不同凝胶间蛋白点匹配，并根据匹配结果计算差异表达倍数，选择差异表达的蛋白点用于质谱分析

6．对于Mascot网站没有全基因组数据的物种该如何进行蛋白的鉴定？

对于已经公布全基因组序列但未在Mascot列出的物种，可以在得到全序列后进行多种生物本地建库并进行本地检索；对于未进行全基因组测序的物种，可以采用近缘物种的数据库进行检索，大大提高了质谱鉴定的效率和成功率。

7．在双向电泳凝胶不同位置的多个蛋白点鉴定出同一个蛋白是什么原因？