聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的分析研究进展

海南大学

期末考试论文

科目：蛋白质工程

题目：聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的研究进展学号： 200904123100**

姓名：郭冬阳

学院：材料与化工学院

系别：生物工程系

专业：生物工程

指导教师：唐敏

完成日期： 2018年 12月29日

聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的研究进展

摘要

随着科学家对蛋白质工程技术的深入研究，聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一，得到越来越广泛的应用。鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对其修饰位点进行分析鉴定成为科学研究的重点与难点。本文主要简述就PEG定点修饰的技术和PE G修饰位点的分析检测方法，并展望了PEG修饰技术未来的发展趋势。

关键词：聚乙二醇；蛋白质药物；结构；蛋白质工程；修饰位点

一、蛋白质药物的聚乙二醇修饰简介

药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上是一种蛋白质工程分子修饰方法。药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。

第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(<200 00>。常用的修饰剂有单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-

SS>、单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-

SC>等,通过酯键或三嗪环将聚乙二醇与药物分子偶联,这种非特异性的不稳定连接方式使得一个药物分子经常连接数个聚乙二醇分子。但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。

以应用相对分子质量高(>20000>聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。

但总得说来,蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。

1.1 修饰氨基

多肽蛋白质分子参与PEG化反应的基团常为α-和ε-

氨基,因此用于修饰氨基的单甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs>种类较多,可分为烷基化mPEGs和酰基化mPEGs两大类。烷基化mPEGs,包括mPEG-醛、mPEG-

三氟乙磺酸及mPEG-环氧化物等。其中mPEG-

醛的修饰条件温和,交联时不引入其他活性基团,在低pH下仅修饰N-

末端氨基,对活性影响较小,同时方便产物的纯化和鉴定,已用于G-

CSF、IFN及CD4-IgG等的修饰。mPEG-三氟乙磺酸的修饰条件也较温和,对GM-CSF修饰后使其保持较好活性。mPEG-

环氧化物虽制备简单,但偶联物含活性羟基,易发生其他交联反应,修饰率也较低。酰基化mPEGs,包括mPEG-琥珀酰亚胺酯和mPEG-

苯并三唑碳酸酯,这两种修饰剂可优先与赖氨酸残基反应,也可与组氨酸和酪氨酸残基反应。此外,mPEG-硝基苯碳酸酯、mPEG-三氯苯碳酸酯及mPEG-

氧羰基咪唑比前述两种反应活性低,但修饰专一性较好。

1.2基于氨基保护的定点修饰

对于蛋白中含有多个修饰位点,可以利用氨基保护试剂对修饰后会导致蛋白失活严重的位点实施保护,对活性高的修饰位点进行定点修饰后,再将保护试剂去除。Youn等研究发现生长激素释放因子(GRF>由于蛋白水解和肾小球过滤作用,其在体内的半衰期非常短,无法有效发挥药效,因此选择PEG修饰技术解决这些问题。但是在该蛋白序列上,有3个修饰位点(Try1,Lys12和Lys21>,其中修饰第21位赖氨酸的氨基可以使蛋白保持最高的生物活性,因此,将1位Try和12位Lys的氨基进行92芴甲氧羰基(FMOC>修饰保护后,用活化mPEG修饰21位Lys获得定点修饰蛋白,然后再将FMOC去除。这样既能保持生物活性,又能获得半衰期长,稳定的蛋白药物。

1.3修饰羧基

有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。一般选用mPEG-酰肼或mPEG-

胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。mPE G-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。

1.4修饰巯基

与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性。

目前可用于巯基修饰的mPEGs包括mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-

二硫醚、mPEG-乙烯基砜及mPEG-碘乙酰胺等。其中mPEG-

马来酰亚胺制备简单,应用较多。PEG-邻吡啶-二硫醚与蛋白质偶联形成的S—

S键,在生理条件下可缓慢水解,释放出天然蛋白质,有利于活性的恢复,但修饰率低。PEG-乙烯基砜在pH7-

9范围内可选择性的与巯基反应,当pH较高时则与氨基交联。PEG-

碘乙酰胺的优势在于经强酸水解后,可释放出半胱氨酸衍生物,易于鉴定。

1.5二硫键定点修饰

对蛋白中含有的二硫键进行PEG定点修饰分为2个步骤:首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基。第二步通过PEG修饰剂的双烷基化反应重建二硫键,从而完成PEG的定点修饰。在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性,而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构,PEG选择性的修饰两个硫基,PEG 的立体屏障作用确保1个二硫键只结合1分子PEG。但是二硫键PEG修饰可能会由于PEG的屏蔽作用,降低蛋白的生物活性。Veronese等利用变性剂盐酸胍(3mol/ L>使蛋白部分变性,高级结构打开,但不使用还原剂以保护二硫键,在非折叠状态下完成PEG修饰后,通过透析或凝胶过滤色谱的方法去除变性剂,使蛋白重新正确折叠恢复生物活性。

1.6非极性氨基酸定点修饰

通常只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行PEG化学修饰。Dei ters等开发了一种定点修饰非极性氨基酸苯丙氨酸的方法,首先用叠氮化物通过亲核取代反应修饰蛋白质中的苯丙氨酸生成对位叠氮化苯丙氨酸,再用炔烃衍生的PEG-

酰胺修饰剂修饰苯丙氨酸,发生环化加成反应形成稳定的连接体,从而完成对蛋白的定点修饰。另外,通过基因重组在蛋白质中引入含叠氮基团的氨基酸残基,再与特定PEG修饰剂偶联形成稳定的定点单修饰产物。Cazalis通过基因工程方法在