分子生物学课件第五章：基因表达调控真核生物

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（3）足纹法（foot printing)
原理：蛋白质结合到DNA序列上，可阻 止核酸酶对其的降解。 方法：DNA序列与靶蛋白进行孵育，再用 DNaseⅠ进行切割，电泳，分析图谱。 应用：确定DNA结合蛋白的识别序列。
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（4）凝胶迁移率（gel shift assay) 或电泳迁移率实验（EMSA）
原理：蛋白质与特定的DNA序列结合后，迁移率 会发生改变， DNA-复合物或RNA-复合物比非结 合的探针移动得慢。
方法：纯化的蛋白或细胞粗提液和同位素标记的 DNA或RNA探针一同保温，聚丙烯凝胶电泳，放射 自显影。
应用：研究DNA结合蛋白；RNA结合蛋白和特定的 RNA序列的相互作用。
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(三)转录后水平的调控
B.糖基化。 ③配体结合 ：(核受体超家族) ④蛋白质与蛋白质相互作用
（2）反式作用因子作用方式
反式作用因子与顺式元件结合如何影响到 远距离RNA聚合酶结合并影响其调控基因？
1）成环（looping） 2）扭曲(twisting) 3）滑动(sliding) 4）Oozing
（3）反式作用因子的组合式调控
• TATA因子与TATA盒结合， 形成稳定的转录复合物，介导 RNA聚合酶Ⅱ分子转录。
• RNA聚合酶Ⅱ识别并结合以 上 蛋 白 质 -DNA 复 合 物 。 形 成 闭合复合物，DNA双链没有打 开，不能启动转录。
真核基因开放的转录起始复合物的形成图
• 转录起始因子与RNA聚合酶 结合，使DNA部分双螺旋解开 成为开放的转录起始复合物， 转录开始合成RNA。
基因表达的调控不是由单一的反式作用因子 完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。
4.转录水平研究方法
（1）报道基因分析法
原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达质 粒中,再转染细胞,通过报道基因的活性可检测转 录活性。 应用：启动子活性的检测 常用的报道基因：Luciferase （荧光素酶）、
GFP（绿色荧光蛋白）、
GCGCGCGC
Gene
DNA 甲基化研究分析方法
原理：甲基化通过影响染色质的结构而调控基因的
转录。通过研究启动子部位的甲基化状态来研究基 因转录活性。 方法：选用识别序列相同但酶切位点不同的对甲基 化敏感性内切酶对待测序列进行酶切。 应用：分析抑瘤基因表达下调的机制；
分析组织/发育阶段特异性基因的表达机制。
碱性-亮氨酸拉链
•亮氨酸之间相互作用 形成二聚体，形成 “拉链” 。
•肽链氨基端20～30个 富含碱性氨基酸结构 域与DNA结合。
亲水性 疏水性 亲水性
DNA结合部位结构域
螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）
含两个双性α-螺旋，每3～4个氨基酸含一个 疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个 能阻断螺旋的氨基酸残基。
2.基因表达的时间性和空间性 时间性：个 体发育的不同阶段，基因表达的种类和数 量是不同的；空间性：在不同组织和器官 中，基因表达的种类和数量是不同的。
3.转录和翻译分开进行 真核生物DNA在核 中转录生成 mRNA，穿过核膜至胞质指导 蛋白质合成；转录和翻译不是同步进行的， 受多层次调控。
4.初级转录产物要经过转录后加工修饰 初级转录产物为核不均一RNA （heterogeneous nuclear RNA , hnRNA）
在结构上含有与DNA结合的结构域。
（1）反式作用因子根据作用方式分为三类：
①通用转录因子。普遍存在的转录因子。如TATA box结合因子 TFⅡD、GC box结合因子SP1 等。
②组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性 有很大关系。
③诱导性反式作用因子。活性能被特异的诱导因子 所诱导。
（2）转录因子(transcription factor，TF )
当细胞对某种基因产物需要量剧增， 单纯靠调节其表达活性不足满足需要，只 有增加这种基因的拷贝数。
不适当的基因扩增可导致某些疾病的 发生。
3.基因重排（gene rearrangement）
指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组 合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。
V
J
C
V
JC
V
J
C
内部剪接位点：内含子部分切除或外 显子部分保留
RNA合成起始所必需的因子。TF不依赖 RNA聚合酶而独立地结合DNA，在转录过程 中促使许多RNA聚合酶分子与启动子结合。
(2) 转录因子结构
TF
DNA结合域
转录活化域
结合其它蛋白质结构域 （如，二聚化结构域）
TFⅢA结构域示意图
TFⅢA肽链的指结构 域含有9个指，与相 应的DNA序列结合， 指“尖”可以进入 DNA双螺旋的大沟或 小沟。但羧基端不具 有指结构，是RNA聚 合酶Ⅲ和其它的转录 因子相互作用的部位。
1.转录起始复合物的形成
转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC)和转录起始复合物 (transcription initiation complex, TIC) 的形成。
真核生物RNA pol不与DNA直接结合， 而需要依靠众多的转录因子。
2. 顺式作用元件(cis-acting element)
（2） 增强子(enhancer)
位于启动子上游或下游并通过启 动子增强邻近基因转录效率的DNA顺 序，增强子本身不具备启动子活性。
(3) 其他元件 包括负调控元件和终止子等。
负调控元件: 沉默子（silencer） 或衰减 子（dehancer）
真核基因内能抑制基因转录的DNA序 列，与反式作用因子相互结合而起作用。 不受距离和方向的限制，并可对异源基因 的表达起作用。
5.染色质结构对基因表达的调控作用
常染色质中疏松状态的活性染色质是基因转 录前在染色质水平上独特的调控机制。
组蛋白与DNA结合与解离是真核基因表达调 控的重要机制之一。
非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。
（二）真核生物基因转录调控 以RNA聚合酶Ⅱ为例
1.转录起始复合物的形成 2.顺式作用元件 (cis-acting element) 3.反式作用因子 (trans-acting factor) 4.转录水平的调控机制
3ˊ端加尾:转录后在mRNA在3ˊ末端加上 50～150个腺苷酸，即poly(A)尾。
意义:保证mRNA在转录过程中不被降解。
2. mRNA前体的选择性剪接(alternative splicing)对基因表达的调控作用
（1）mRNA前体的剪接 真核细胞基因表 达所转录出的mRNA前体在剪接酶作用下， 有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来， 形成成熟的mRNA，这一过程即为剪接。
真核Ⅱ类基因的顺式作用元件图
①核心启动子(core promoter) 包括“转录起始位点”及其上 游-25～-30 bp 处富含TA的典型元件“TATA”盒。核心序列为 TATAAAA，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。
②上游启动子元件( upstream promoter element, UPE) 包 括 通 常 位 于 -70 bp 附 近 的 CAAT 盒 (CCAAT) 和 GC 盒 (GGGCGG），功能：调节转录起始的频率，提高转录效率。
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5.不存在超基因式操纵子结构 真核生物基因 转录产物为单顺反子。
6.部分基因多拷贝 某些基因以多拷贝形式存 在，如组蛋白和 tRNA等，这样既可满足细 胞的需要，也是表达调控的一种有效方式。
单顺反子(monocistron)
编码一个多肽链的DNA的序列 区域，相当于真核细胞的一个基因。
单顺反子mRNA (monocistronic mRNA)
1. 5ˊ端加帽和3ˊ端多聚腺苷酸化及意义
5ˊ端加帽:真核生物转录生成的mRNA在转录后， 在5ˊ端加上7－甲基鸟苷 (m7GPPPmNp-)。
意义:保护转录体mRNA不受5ˊ外切酶降解， 增强mRNA稳定性，有利于mRNA从细胞核向胞 质转运，促进mRNA与核糖体结合（通过帽结合 蛋白介导完成）。
SEAP（分泌性碱性磷酸酶）
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（2）DNaseⅠ超敏感分析法
原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经 DNaseⅠ消化常出现长短不均一的100－200 bp 的 DNA片段，说明此 DNA 受组蛋白掩盖的结构有变化， 出现了对DNaseⅠ高敏感点(hypersensitive site)。 方法：用 DNaseⅠ处理细胞核DNA，再用合适的内切酶 进行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行 southern 杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。 应用：确定基因启动子内调控区的位置。
DNA Promoter
Gene
transcription
mRNA 5′
3′
translation
Protein
二、真核生物基因表达的调控机制
（一）基因组DNA水平的调控
1.染色质的丢失 不可逆的调控。 线虫 胚胎期：1090个细胞 成 虫：959个细胞 131个细胞在发育过程中发生凋亡
2. 基因扩增（gene amplification）

2)转录活化结构域 （transcriptional activation domain）
①酸性α-螺旋（acidic α-helix domain） 能非特异 性地与起始复合物（如TATA盒结合因子）相互作用 发挥转录活化功能。
②富含谷氨酰胺的结构域（glutamine-rich domain） 最强的转录活化域之一。
终止子
在模板DNA分子的5′端转录终止信号。 通常具有po1yA尾的基因终止信号为G／T 簇，例如在SV40中的AGGTTTTTT序列为 终止转录调控元件。
3.反式作用因子(trans-acting factor)