固相萃取气相色谱_质谱法测定蔬菜中含氮杂环农药残留

第16卷第3期2010年09月分析测试技术与仪器ANALYS IS AND TEST I NG T EC HNOLOGY AND I N S TRUM ENTSV o l u m e16N u m ber3Sep.2010分析测试新方法(179~184)固相萃取气相色谱-质谱法测定蔬菜中含氮杂环农药残留吴 芳1,2,段红斌1,张 兰1(1.福州大学食品安全分析与检测教育部重点实验室,福建福州 350002;2.福建医科大学药学院,福建福州 350108)摘 要:建立了固相萃取(SPE)气相色谱-质谱(GC-M S)同时测定蔬菜中敌菌灵、噻菌灵、氟虫腈和噻嗪酮4种含氮杂环农药残留量的分析方法.蔬菜样品用乙腈匀浆提取后经弗罗里硅(F l or isil)固相萃取柱净化.采用GC-M S 检测,在选择离子检测(SI M)模式下以特征离子定量,用全扫描(SCAN)方法确证.方法具有良好的线性关系(R0.9953)和重现性(峰面积RSD9.1%),最低检出限(S/N=3)在3.6~1.8!10-4 g/mL之间,4种农药添加回收率在76.1%~116.4%之间,RSD9.8%,用于实际样品菜心的检测,结果满意.方法操作简单,灵敏度高,可作为测定各种蔬菜基质中含氮杂环农药残留量的确证方法.关键词:含氮杂环农药;固相萃取;气相色谱-质谱;蔬菜中图分类号:O657.3文献标识码:B文章编号:1006 3757(2010)03 0179 06近年来,农药残留检测领域中相继出现一类新颖的杂环和稠杂环结构的农药新产品.在该类农药新产品中,含氮杂环农药(n itrogen-conta i n i n g heterocyc li c pesticides)尤其重要,氟虫腈、噻嗪酮、敌菌灵和噻菌灵是使用最为广泛的几种氮杂环农药.其中,噻嗪酮、氟虫腈是杀虫剂,敌菌灵、噻菌灵是广谱杀菌剂,具有高效、低毒、适用范围广等特点,常用在粮食蔬菜等农作物中.但这些农药均具有强内吸性与长持效性,故残留期较长,大量使用后对人、动物和环境产生的危害也日益严重.随着人们食品安全意识的增强,蔬菜中农药残留问题也得到了更大的关注.例如,欧盟指令2076/2002中明确规定禁止在叶果类蔬菜中使用敌菌灵[1];我国农业部也要求自2009年7月1日起,除卫生用、部分旱田种子包衣剂外,我国境内停止销售和使用用于其他方面的含氟虫腈成分的农药制剂[2].因此建立该类农药快速有效的分析方法,以保证农作物食品的安全性,是很有必要的.目前,国内外有关食品中农药检测方法的研究较多.但是由于食品基质的复杂性及农药性质的差异,研究主要集中于有机磷、有机氯等,对含氮杂环农药残留的研究较少,针对蔬菜基质中这几种含氮杂环农药的快速检测方法未见报道.检测包括气相色谱法[3]、液相色谱法[4]以及其他色谱联用技术[5-8].其中,气相色谱-质谱法(GC-MS)具有高的检测灵敏度和专属性,是公认的复杂基质中低浓度农残检测的有效方法.样品前处理方法主要有液液萃取法[9]、柱层析法[10]和固相萃取(SPE)[11-12]等,其中SPE克服了液液萃取和柱层析法的缺点,具有高效、简便、重现性好、易于自动化等优点,是目前较优越的一种前处理方法,被广泛应用于蔬菜、水果中的农残分析.本文采用自制的弗罗里硅(Florisil)固相萃取柱提取净化蔬菜中4种含氮杂环农药,建立了同时测定蔬菜中多种含氮杂环农药的GC-M S分析方法,方法简单可靠,准确度高,成本低,满足蔬菜中农残监控的需要.收稿日期:2010-03-10; 修订日期:2010-05-21.作者简介:吴芳(1975-),女,讲师,在读博士,主要从事色谱分析.通讯作者:张兰,教授,研究方向:色谱、食品安全及药物分析.T e:l(0591)87893207,E-m a i:l zl an@分析测试技术与仪器第16卷1 实验部分1.1 仪器与试剂仪器:气相色谱与质谱联用仪(Ag ilent techno l o g ies 6890N -5973i),HGC -24A 型氮吹仪(厦门精艺兴业科技有限公司),控温多用捣碎机调速机79型(江苏江阴保利科研器械有限公司).试剂:敌菌灵、噻菌灵购于Sig m a 公司;噻嗪酮、氟虫腈购于国家农药质检中心.丙酮(色谱纯)、弗罗里硅(F l o risi,l 100~350 m )购于国药集团化学试剂有限公司;实验用水为去离子水,其余试剂为分析纯.1.2 实验过程1.2.1 标准储备液和工作液的配制称取噻菌灵农药标准品10.00m g ,用色谱纯丙酮溶解并定容于10mL 容量瓶中,即得1.00m g /m L 的噻菌灵标准储备液,在4∀冰箱保存备用.使用时母液用丙酮稀释至所需浓度.其他农药标准品溶液按照噻菌灵的配制方法进行配制,标准储备液浓度均为1.00m g /mL .1.2.2 固相萃取小柱的制备预先将Florisil 在620∀下烘烧4h 后置干燥密闭容器储存,使用前在140∀下烘烧2h ,趁热加入5%的水灭活后装柱.固相萃取柱为6mL 的注射针筒底部装聚四氟乙烯筛板,将F l o risil 填料均匀装入压实后即可[13].1.2.3 样品前处理取不少于1000g 的蔬菜样品,用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物.将其切碎后采用对角线分割法,取对角部分备用.准确称取25.00g 上述蔬菜样品于100mL 烧杯中,加50mL 乙腈,转移到高速匀浆机中,高速匀浆2m i n 后过滤到100mL 具塞刻度量筒并加入5~7g NaC ,l 剧烈振摇1m in ,静置10m i n ,使乙腈相与水相分层.准确吸取10.00mL 上层乙腈相溶液,移至10m L 具塞刻度试管,50∀氮吹到近干.加1.00mL 丙酮溶解残渣,涡旋混匀1m i n ,留待净化.Florisil 固相萃取柱先经5mL 乙腈和5m L 丙酮活化后,将样品提取液上柱,用V (乙腈)#V (丙酮)=9#1混合溶液10mL 分3次洗涤样品试管并淋洗固相萃取柱,收集洗脱液,50∀氮吹到近干,用丙酮定容到1.00mL,过0.22 m 滤膜,进行GC -M S 分析.1.3 GC-M S 条件H p-5M S,30m !0.25mm !0.25 m 弹性石英毛细管柱;柱温:程序升温150∀,保持1m i n ,以30∀/m in 的速度升温至200∀,保持7m i n 再以40∀/m i n 的速度升温至280∀;载气:高纯氦( 99 999%),柱流量:0.8mL /m i n ,恒流.进样口温度:280∀;接口温度:300∀;进样模式:不分流进样,0.75m in 打开purge 阀;进样量:1 L ;四极杆温度:150∀;离子源:E I 源;电子能量:70e V;离子源温度:200∀.全扫描(SC AN )模式,扫描范围45~400m /z .数据采集方式:选择离子检测(S I M ).各农药选择检测离子和定量离子见表1.表1 含氮杂环农药的监测离子与定量离子T ab le 1 M on itori ng i ons and quan titati ve i on s of four nitrogen -conta i n i n g heterocyc lic pesticides 分析物结构式检测离子/(m /z)定量离子/(m /z)敌菌灵(An ilazi ne)178239241239噻菌灵(T h i abendazo le)174201202201氟虫腈(F ipronil )213255367367噻嗪酮(Buprofezi n)105172305305180第3期吴芳,等:固相萃取气相色谱-质谱法测定蔬菜中含氮杂环农药残留2 结果与讨论2.1 GC -M S 监测模式的选择蔬菜基质复杂,当样品中被测物质浓度较低时,SCAN 模式下的总离子流图(T I C )中的样品峰容易被掩盖.采用SI M 模式,能有效地去除基质干扰,且灵敏度得到了显著提高,有利于定量.因此,本方法采用SI M 模式初筛及定量,采用SCAN 模式获得质谱全图,并将其与标准品的谱图进行对照,使检测结果更为准确.4种含氮杂环农药混合标准溶液的气相色谱如图1所示.从图可知,在SCAN 模式下4种农药峰交错在一起,因此采用SI M 模式,针对单个离子分别进行提取,从而使得4种物质得到很好的定性和定量.图1 4种农药的总离子流图(a)和提取离子流图(b )Fig .1 SCAN chro m atogra m (a)and SI M -E I C ch ro m atogra m s (b)of fou r pe stic i des2.2 提取方法和提取剂的选择食品中残留农药常用的提取方法有浸渍法、震荡法、超声波提取法、匀浆法等.其中匀浆法操作简单,提取的分析物用盐析法使两相分离,不仅减少了有机溶剂的用量,而且节约了时间,提取效果好,能更好的实现快速检测.本实验采用匀浆法提取,并且比较了丙酮、乙腈的提取效果,结果表明50mL 的丙酮为提取剂时回收率低于30.2%,而采用乙腈提取,回收率在85.9%~103.7%之间,因此选择乙腈作为提取剂.2.3 固相萃取条件优化2.3.1 吸附剂用量的选择由于F l o risil 通用性好,对极性和非极性农药都有很好的萃取能力,常用于农药残留的净化且其价格低廉,具有很高的推广应用价值.实验选择F l o risil 为吸附剂.由于吸附剂的质量是影响吸附容量的关键因素,吸附剂越多,吸附容量越大,因此考察了不同质量的F l o risil(200、500m g)对农药的萃取效果.结果表明,用5mL 的V(乙腈)#V (丙酮)=1#1混合溶液进行洗脱,Florisil 填料量为200m g 时,4种农药的回收率在59.3%~76.9%之间,回收率偏低;而在填料量为500m g 时,噻菌灵、氟虫腈、噻嗪酮的回收率均在90%以上,敌菌灵的回收率为68.9%,已经可以满足实际样品的分析.因此选择500m g 的Florisil 作为固相萃取填料.2.3.2 洗脱剂的选择洗脱剂是影响分析物SPE 洗脱行为的重要因素.弱极性洗脱剂,洗脱不完全,回收率低;强极性的洗脱剂往往会带来其它杂质,影响后续的色谱分离过程[14].对比研究了正己烷、二氯甲烷、V (乙腈)#V(丙酮)=1#1、V(二氯甲烷)#V (甲醇)=86#14和甲醇5种洗脱剂对农药的洗脱效果,结果见图2.实验图2 洗脱剂种类对洗脱效率的影响F ig .2 E ffect of d ifferen t eluan ts on recovery表明,二氯甲烷、正己烷对噻菌灵的洗脱效果偏低,这可能是由于噻菌灵极性较大,因而难于被极性小的溶剂洗脱.而V(二氯甲烷)#V (甲醇)=86#14和甲醇对敌菌灵的洗脱效果不佳.采用V (乙腈)#V (丙酮)=1#1混合溶剂洗脱时,各分析物回收率在75.9%~85.0%之间,故选择该溶液作为洗脱剂.进一步比较不同体积比的乙腈/丙酮混合洗脱剂对洗脱效果的影响,结果表明(图3),随着乙腈比例的181分析测试技术与仪器第16卷图3 乙腈/丙酮混合洗脱剂配比对洗脱效率的影响Fig.3 E ffect ofm atching of e l uan t vol um e on recovery增加,氟虫腈、噻嗪酮的回收率基本保持不变,敌菌灵、噻菌灵的回收率呈现上升的趋势,当乙腈/丙酮的体积比为9#1时,各农药回收率更接近100%,因此最终选择洗脱剂为V(乙腈)#V(丙酮)=9#1.比较了不同体积的V(乙腈)#V(丙酮)=9#1洗脱剂对洗脱效果的影响,结果发现,随着洗脱剂的用量从4 mL增加到10mL,4农药的回收率均有所增加,洗脱剂用量为10m L时,回收率在99.3%~102.3%之间,因此确定洗脱剂体积为10mL.2.4 方法的线性范围及检测限配制一系列混合标准溶液,在选定的最优化条件下进行GC-M S分析,分别以选定的定量离子峰面积(y)对含量(x, g/mL)绘制标准曲线.结果表明,4种目标物有良好的线性关系(R 0.9953)和重现性(峰面积RSD9.1%),噻嗪酮最低检测限(S/N=3)可达0.18ng/mL(见表2),可以满足残留定量分析的要求.2.5 方法的回收率和精密度为了考察方法的可靠性,分别在白菜、花菜、胡萝卜、青椒等4种空白蔬菜样品中加入不同浓度的敌菌灵、噻菌灵、氟虫腈和噻嗪酮混合标准溶液,按照实验方法测定回收率.GC-M S各种基质中高添加水平下的回收率在80.3%~103.7%之间,相对标准偏差(RSD,n=5)小于9.8%.低添加水平下的回收率在76.1%~116.4%之间,相对标准偏差(RSD,n=5)小于9.6%(表3).3 市售蔬菜的检测利用所建立的方法,对市场上的菜心进行检测.样品经过SI M初筛后,发现有噻嗪酮残留.对该样品进一步进行SC AN分析(见图4),所获得的质谱图与标准品的质谱图进行比对,匹配度达99%,从而可确定菜心样品中含有农药噻嗪酮.此外,从图4可知,噻嗪酮农药的峰面积很大,其SI M实验结果表2 4种农药的线性方程、线性范围和相关系数T ab le2 L inear equation,li near ran ge and correlati on coeff i c ien t of four pesticides分析物线性方程相关系数线性范围/( g/mL)检测限/( g/mL)R SD/%敌菌灵(A nil a zi ne)y=2.8!106x-2.0!1070.99627.2~503.69.1噻菌灵(Th iabenda zole)y=2.2!106x-4.7!1050.99730.3~2.00.29.4氟虫腈(F i pron il)y=2.0!106x-3.0!1030.99531.8!10-3~2.4!10-24.5!10-47.8噻嗪酮(Bupro fezi n)y=6.3!105x-31.10.99927.2!10-4~5.0!10-31.8!10-43.1表3 蔬菜基质中四种含氮杂环农药的回收率Tab le3 R ecover i es of four n itrogen-con tain i ng h eterocyclic pe stic i des in variou s vegetab le sa m p les分析物添加水平/( g/kg)回收率/%,n=5白菜花菜胡萝卜青椒R SD/%,n=5白菜花菜胡萝卜青椒敌菌灵80.0082.785.391.883.64.96.58.53.840.0091.1109.496.392.89.37.99.17.8噻菌灵80.00103.7101.9103.387.37.34.59.85.340.0099.677.5116.496.88.16.39.67.4氟虫腈0.8085.9103.699.6102.18.65.57.55.80.4077.176.195.181.89.17.88.57.2噻嗪酮0.32101.680.395.299.04.53.55.11.5182第3期吴芳,等:固相萃取气相色谱-质谱法测定蔬菜中含氮杂环农药残留图4 最优化条件下菜心实际样品的GC-M S总离子流色谱图Fig.4 T otal ion curren t chro m atogra m of flo w eri ng Ch i n ese cabbage under op ti m al cond itions已超出了本方法的线性范围上限,说明噻嗪酮在市售菜心中的残留十分严重.4 结论本研究实现了蔬菜中多种含氮杂环农药残留的快速测定,为蔬菜中多种含氮杂环农药残留检测提供了依据.方法采用GC-M S分离检测,可靠性高,定性定量分析准确,检出限低,能满足实际样品中氮杂环农残的检出要求.样品前处理快速简便,采用自制的国产Florisil柱净化,实验成本低,且可同时进行批量化处理,有利于推广普及.参考文献:[1] COMM ISSI ON REGULAT I ON(EC)N o2076/2002[OL].(2002-11-20).h ttp://eur-lex.europa.eu/L exU ri Serv/L ex U riSe rv.do?uri=O J:L:2002:319:0003:0011:EN:PD F.[2] M i n i stry o f A gr i culture.N o.1157Bu lleti n o f t heM i n i stry o f A griculture of the People's R epubli c o fCh i na(农业部.中华人民共和国农业部公告第1157号)[EB/OL].(2009-2-25).http://www.scag r.i/z w gk/tzgg/200904/P020090416607685157724.doc.[3] Jos F,P ilar H,Car m en M M,et al.M ultiresi duem e t hod for ana lysis of pestici des i n pepper and tom atoby gas chrom atog raphy w ith nitrogen-phospho rusde tecti on[J].Food Chem,2007,105:711-719. [4] 赵洁,何强,孔祥虹,等.固相萃取分离-高效液相色谱法测定陈皮中噻菌灵残留量[J].理化检验-化学分册,2009,45(2):215-217.[5] Ji m nez J J,Berna l J L,N oza l M J,et al.Sa mp lepreparati on me t hods t o ana l y ze fipronil i n honey by gaschrom atography w ith e l ectron-capt ure and m assspectrom etr i c detecti on[J].J Chrom atogr A,2008,1187:40-45.[6] Stanisla w W.Deve l op m ent of a mu lti-residue me t hodfor the dete r m ina tion of pesti c i des i n cereals and dryan i m a l feed usi ng g as chroma tog raphy-tandemquadrupo l e m ass spectrome try II.I mprove m ent andex tension t o new analytes[J].J Ch ro m a t og r A,2008,1208:202-214.[7] R ome ro-G onz lez R,G arr i do F A,M art nez V J L.M u ltiresi due m ethod for fast de ter m i nati on o f pestici desin fru i t j u i ces by ultra performance liquidchrom atography coupled t o tandem m ass spectro m e try[J].T a l anta,2008,76:211-225.[8] 郑军红,庞国芳,范春林,等.液相色谱-串联四极杆质谱法测定牛奶中128种农药残留[J].色谱,2009,127(3):254-263.[9] E l pini k iG A,T rianta fyll os A A.M u lti resi due me t hodfor de ter m i na ti on of35pestici des i n v irg i n o li ve o il byusi ng liqu i d-liquid ex tracti on techn i ques coupled w ithso li d-phase extrac tion c l ean up and gaschrom atography w ith nitrogen phospho rus detection ande lectron capt ure detec tion[J].J A gr i c F ood Che m,2006,54:9642-9651.[10] 赵孝宁,汤锋,唐俊,等.谷物及土壤中氟虫腈残留分析方法研究[J].中国农学通报,2009,25(16):250-254.[11] B i chon E,R ichard C A,Le B B.D evelop m ent andva li da ti on o f a m et hod for fipronil res i due de ter m i nati onin ov i ne p las m a usi ng96-we ll plate so li d-phaseex tracti on and gas chro m a t og raphy-tandem m assspectrom etry[J].J Chroma tog r A,2008,1201:91-99.[12] 郑向华,方恩华,吴敏,等.气相色谱-负化学离子源质谱联用法测定植物性产品中多组分农药残留量[J].分析试验室,2009,28(9):99-102. [13] 陆万平,游飞明,李鑫,等.茶叶中有机氯和拟除虫菊酯多种农药残留同时分析的样品前处理研究[J].分析测试技术与仪器,2009,15(2):101-105.[14] 张卓,陈金泉,张兰.固相萃取-高效液相色谱联用分析蔬菜中5种有机磷农药[J].分析测试技术与仪器,2008,14(2):87-91.183184分析测试技术与仪器第16卷Deter m inati on ofN itroge n-contai ni ng Heterocyclic Pestici deResidues in Vegetables by Soli d-phaseExtracti on Coupli ng of Gas Chro m atography-M ass Spectro m etryWU Fang1,2,DUAN H ong-b i n1,Z HANG Lan1(1.K e y Laboratory of A naly sis and D etecti on for F ood Safet y,M inistry of Education,Fuzhou Universit y,Fuzhou350002,China;2.C ollege of Pharmacy,Fujian M e d ical University,Fuzhou350108,China)Abstrac t:A so lid-phase ex tracti on(SPE)co m b i ned w ith gas chrom atography-m ass spectrom etry(GC-M S)fo r t he deter m i na ti on o f four n itrogen-conta i n i ng heterocyclic pestic i des(an ilazi ne,fi pron i,l buprofezin,thiabendazo l e)in vegetables has been deve l oped. T he sa mp le w as ex trac ted w ith acetonitrile,pur ifi ed on a hom e m ade F lor i sil-SPE co l u mn and deter m i ned w ith GC-M S.T he analytes w ere quantitated by mon it o ri ng i ons and con fir m ed w ith the SCAN mode.T he m ethod sho w ed good li near it y(R 0.9953)and repeatab ility(R S D9.1%for t he peak area).T he li m i ts of detecti on for the four pestic i des w ere bet w een3.6~1.8!10-4 g/mL (S/N=3).R ecove ries o f the fou r pestic i des ranged from76.1%t o116.4%w ith RSD s9.8%.The m ethod w as app lied to the deter m i nation o f trace pesticide res i dues i n flower i ng Ch i nese cabbage samp l es from the local ma rket w ith satisfactory results.T he m ethod i s si m ple,accura te and suitable to the analysis o f n itrog en-con taini ng hetero cyc lic pesticides i n vege tab l es.K ey words:nitrogen-con taini ng heterocy cli c pesti c i des;so lid-phase ex trac ti on;gas chro m atog raphy-m ass spectrom etry;vegetablesC l assifyi ng nu m ber:O657.32。