微生实验报告 2012.10.31 实验四 酵母菌的形态观察及细胞死活的鉴别,微生物细胞大小的测定

微生实验报告
姓名：王晶晖
专业年级：2011级生物技术
学号：040312011032
实验四酵母菌的形态观察及细胞死活的鉴别，微生物细胞大小的测定
一、实验目的
1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法.
3．了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。

二、实验原理
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。

因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。

用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。

测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长10μm，每格长（0.01mm），是专门用来校正目镜测微尺的。

校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法的优点是直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的
计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的（0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。

由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。

中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数
因1ml=1cm3=1000mm3，
同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则
三、实验仪器
1、显微镜
2、血球计数板
3、目镜测微尺
4、镜台测微尺
5、盖玻片
6、吸水纸
7、计数器
8、移液器
9、擦镜纸
四、实验试剂
1、菌种：培养48h的酵母菌
2、染色液和试剂：0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝
五、实验步骤
１、目微尺的校正：
把Olympus目镜的下部罗圈旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。

先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。

因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。

用同法分别校正在低倍镜下和高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

2、酵母菌形态观察及死活细胞鉴别
1）制片：在一个载玻片上分别滴0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝各1滴，无菌操作取酵母菌，在染液中分别混匀，盖上盖玻片，静置5分钟。

2）镜检：在显微镜高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。

3）计数死活细胞：死细胞为染为兰色的细胞，活细胞为无色细胞，分别计数，并隔5-15分钟检测一下死活细胞数，比较其死活细胞的比例变化。

3 细胞大小的测定：
移去镜台测微尺，换上酵母菌染色片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测徽尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。

测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。

一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，才能代表该菌的大小。

待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。

六、实验结果
1、绘图说明酵母菌形态及出芽方式
2、为什么目镜测微尺使用前必须校正？
答：因为不同的物镜、目镜以及显微镜本身会产生放大倍数的差异，因此要校准显微测微尺，以便使结果精确。

物镜目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺校正值
（um）
10×25 10 4
40×48 2 0.42
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平
均
值长 4 4 5 5 4.5 5 4.5 4.5 5 5 5.5 5 5 5.5 7 5 宽 3 4 4 4.5 3.5 4 3.5 3.5 4 4 4.5 4 4 5 4.5 4 测得酵母菌宽约4.15μm，长约5.22μm
二室平均菌数为815000000
七、思考题
1、为什么目测尺使用前必须校正？
答：因为不同的物镜、目镜以及显微镜本身会产生放大倍数的差异，因此要校准显微测微尺，以便使结果精确。

2、吕氏碱性美蓝染色液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死活细胞数量有何影响？
答：吕氏碱性美蓝染色液浓度过高或作用时间过长会造成细胞脱水死亡并渗透染液，造成更多的死细胞，影响实验结果；吕氏碱性美蓝染色液浓度过低或作用时间过短会使死细胞染不上颜色，不利于观察。

3、你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的主要区别是什么？
答：细菌为很多圆球状或小杆状,放线菌像乱线团,霉菌为很多乱粗枝,酵母是较细菌明显大一点的椭圆球状
4、根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面，应如何尽量减少误差，力求准确？
答：误差来自于：
1、细胞溶液没有摇匀，大量细胞沉积在试管底部。

2、平行测定次数不够多，偶然性增大。

3、由于仪器不够准确精密。

如何减少误差：
1、待测菌悬液要纯净，而且浓度要适中。

2、增加实验重复的次数，减小偶然性。

3、使用更精确的仪器，操作规范。