微囊藻毒素生物合成基因及其功能研究进展

微囊藻毒素生物合成基因及其功能研究进展

摘要：水体富营养化加剧，导致了蓝藻水华在世界范围内频发。蓝藻产生的微裳藻毒素是最常见的一种藻毒素，对人类和动物造成了很大的危害甚至导致死亡。微囊藻毒素经非核糖体合成途径由多肽合成酶合成。对微囊藻毒素的结构与性质、微囊藻毒素合成基因的功能及其生物合成、微囊藻毒素的分子生物学检测技术进行了评述，对未来的研究方向进行了展望。

关键词：微囊藻毒素；蓝藻：基因；检测

随着社会的发展，生活及工农业生产中大量含氮、磷的废污水未经有效处理被排入水体中，导致水体富营养化，蓝藻等藻类成为水体中的优势种群，大量繁殖形成水华，蓝藻水华暴发带来的微囊藻毒素（microcystin，MC）污染已经成为全球关注的环境问题。微囊藻毒素造成了众多中毒事件，对人类和动物的健康造成了很大的威胁。深入认识微囊藻毒素，了解微囊藻毒素的结构、编码基因及其合成，有助于对微囊藻毒素进行有效的监测，对微囊藻毒素的合成进行干预，从而在监测、控制和消除等方面有效解决微囊藻毒素的危害问题，对水体环境的保护具有重要的现实意义。

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微囊藻毒素的结构与性质

微囊藻毒素是一种单环七肽肝毒素，一般结构为环（D-Ala-X-D-MeASp/D-Asp-Z-Adda—D-Glu-Mdha）（图1）。分子结构1位上是D-丙氨酸（D-Ala）；2、4位上的X和Z分别代表不同的氨基酸；3位上是D-赤-β-甲基天冬氨酸（MeAsp）；5 位上是（2S，3S，8S，9S）-3-氨基—9—甲氧基一2，6，8-3甲基-10-苯基-4，6-_烯酸（Adda）；6位上是D一谷氨酸（D-Glu）；7位上是N一甲基脱氢丙氨酸（Mdha）。其中.Adda是一种特殊氨基酸，是毒素活性表达所必需的基团，其结构改变会导致毒性减弱或丧失。因为结构中存在可变氨基酸，所以微囊藻毒素有多种异构体，目前发现的已经超过90种。其中最普遍、毒性较大的是MC-LR、RR和YR（L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）。

微囊藻毒素对蛋门磷酸酶1和2A的活性具有抑制作用及多种毒效应。肝脏是微囊藻毒素主要的靶器官，微囊藻毒素会引起肝脏炎症、肝损坏甚至坏死，另外其还与肿瘤促进作用有联系。腹腔注射小鼠实验发现MC-LR半致死率（lethal dose 50% LD50）为50 μg/kg，MC-RR和MC-YR毒性相对较低。世界卫生组织（WoI-ld Health Or-ganization，WHO）规定饮用水中微囊藻毒素的含量不得超过为1μg/L。微囊藻毒素具有较好的水溶性，在水中的溶解度大于1g/L，另外还能溶解于丙酮和甲醇。微囊藻毒素还具有很高的耐热性，加热煮沸都不能将其去除。由于微囊藻毒素的这些性质，常规的水处理工艺不能将其有效去除，因此对微囊藻毒素的检测以及预防显得尤为重要。

2 微囊藻毒素的合成基因及基因功能

微囊藻毒素由聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）和非核糖体合成酶（non-ribosomal peptidesynthetase，NRPS）等特殊的酶利用氨基酸或者化合物，绕开核糖体，通过非核糖体合成途径完成合成，微囊藻毒素合成基因（microcystin syn-thetase genes，mcy），是第一个被完全测序的蓝藻代谢物合成基因。Tillett 等最先解析了微囊藻属（Microcystis）PCC7806的mcy基因，基因全长55kb，包含mcyA -C和mcyD -J两个操纵子，共有10个开放阅读框，主要编码PKS和NRPS。mcyD-j操纵子，编码PKS、NRPS和PKS混合的杂交酶、剪裁酶、以及转运酶；mcyA -C操纵子，主要编码3个NRPS。

微囊藻毒素的主要产毒藻种为微囊藻、鱼腥藻（ANABAENA）和浮丝藻（Planktothrix），3个藻属的mcy基因均已测序和鉴定出来，各个藻属mcy基因的基因单元在结构上是相似的，但是在基因的排列上略有不同（图2）。在基因单元方面，对比3个藻属可以发现，浮丝藻属无mcyF和mcyl基因，而多了mcyT 基因。在基因排列上，微囊藻属和鱼腥藻属的两个操纵子呈相反方向排列，而浮丝藻属的操纵子呈单向排列（mcyT除外）。

下面以微囊藻PCC7806合成微囊藻毒素（MC-LR）为例，根据mcy基因参与合成的顺序详细介绍这10个基因以及它们在合成中的作用（图3）。mcyG、mcyD和mcyE共同完成Adda的合成；mcyE还参与D—谷氨酸和L-丝氨酸的加入；mcyA参与Mdha的加入；mcyB参与L一亮氨酸和MeAsp的加入；mcyC 参与L-精氨酸的加入，并完成环化，最终完成MC-LR的合成。

2.1 mcyG

Adda是微囊藻毒素毒性表达所必需的基团，根据相关酶的同源性和生物信息学的分析，Adda在，mcyG、mcyD、mcyE和mcyJ的共同作用下合成，mcyG 完成其第一步合成。mcyG位于mcyF上游，全长7 896 bp，编码294 266 D的多肽，为PKS和NRPS。mcyG氨基末端的NRPS模块含有氨酰基腺苷酰化结构域（amiinoacyl adenylation，A），利用ATp，活化苯丙素，活化的苯丙素被转移至硫醇化结构域（thiolation），之后进入PKS通路。活化的苯丙素单元随后在丙二酰辅酶A （malonyl-CoA）的延伸作用以及mcyD、E、G的PKS通路的修饰下逐渐延伸。PKS含有β一酮酯酰合成酶（β -keloacyl synthase，KS）、酰基转移酶（acyltransferase，AT）、C-甲基转移酶（C-methyltransferase，CM）、酮酯酰还原酶（β-ketoacyl reductase，KR）和酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）结构域。Moore等研究发现，AT结构域可能与丙二酰辅酶A的接收有关。在AT 结构域的作用下，丙二酰辅酶A上的丙二酰基团被转移到ACP结构域上，依次经KS结构域进行脱羧缩合反应、CM结构域编码C-甲基转移酶对S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）进行甲基化作用、KR结构域进行州还原作用，完成第一个丙二酰辅酶A延伸，从而完成Adda的第一步合成。2.9 mcyC

mcyC使L-精氨酸加入合成链，并完成环化步骤。mcyC位于mcyB下游，