第八章酶应用
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酶工程课件 5 第八章_酶定向进化
通常采用连续易错PCR ( Sequential error prone PCR) ： 将一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的模板, 连续反复进行随机诱变。
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
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生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
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如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
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天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
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现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
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生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
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如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
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天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
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现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
8酶的工业应用
-酪氨酸酶
可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成多巴。已经制 成固定化酶使用。
多巴是治疗帕金森氏综合症的一种重要药物。 该酶作用pH为3.5-6.0，温度为30-55℃，为控
制氧化进程，应添加维生素C或硫酸肼等抗氧 化剂。
三、酶在药物制造方面的应用
核苷磷酸化酶
可催化阿糖尿苷生成阿糖腺苷；而阿糖尿苷由 尿苷通过化学方法转化而成；
由于酶具有专一性强和效率高的特点，所 以在医药方面使用的酶具有种类多、用量 少、纯度高的特点。
一、酶在疾病诊断方面的应用
根据体液内酶活力的变化诊断疾病
酸性磷酸酶（ACP） • 前列腺癌患者及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血 球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力会升高。
碱性磷酸酶（ALP或AKP） • 佝偻病、骨骼软化症、骨瘤、骨骼广泛性转移癌、甲 状旁腺机能亢进、黄疸性肝脏疾病等，患者血清中碱 性磷酸酶活力升高；而软骨发育不全等疾病，引起该 酶活力下降。
脱除苦味和防止出现白色浑浊； 葡萄糖氧化酶：可去除果汁、饮料、罐头食品和果蔬干
制品中的氧气，防止产品氧化变质，防止微生物生长， 延长食品保存期； 溶菌酶：可防止细菌污染，起保鲜作用等。
果胶酶的作用机理
酯化的半乳糖醛酸
柚苷（柚配质-7-芸香糖苷） 橙皮苷（橙皮素-7-芸香糖苷）
四、改善食品的品质和风味
风味酶的发现和应用，在食品风味的再现、强化和矫正 方面有广阔应用前景。例如： 用洋葱风味酶处理甘蓝等蔬菜； 用奶油风味酶（脂肪酶）作用于含乳脂的巧克力、冰 淇淋、人造奶油等食品； 端肽酶水解苦味肽消除苦味； 风味酶用于恢复甚至强化原来的天然风味。
面包制造中，面团中添加适量的-淀粉酶和蛋白酶，可 缩短面团发酵时间，面包品质也有提高。
可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成多巴。已经制 成固定化酶使用。
多巴是治疗帕金森氏综合症的一种重要药物。 该酶作用pH为3.5-6.0，温度为30-55℃，为控
制氧化进程，应添加维生素C或硫酸肼等抗氧 化剂。
三、酶在药物制造方面的应用
核苷磷酸化酶
可催化阿糖尿苷生成阿糖腺苷；而阿糖尿苷由 尿苷通过化学方法转化而成；
由于酶具有专一性强和效率高的特点，所 以在医药方面使用的酶具有种类多、用量 少、纯度高的特点。
一、酶在疾病诊断方面的应用
根据体液内酶活力的变化诊断疾病
酸性磷酸酶（ACP） • 前列腺癌患者及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血 球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力会升高。
碱性磷酸酶（ALP或AKP） • 佝偻病、骨骼软化症、骨瘤、骨骼广泛性转移癌、甲 状旁腺机能亢进、黄疸性肝脏疾病等，患者血清中碱 性磷酸酶活力升高；而软骨发育不全等疾病，引起该 酶活力下降。
脱除苦味和防止出现白色浑浊； 葡萄糖氧化酶：可去除果汁、饮料、罐头食品和果蔬干
制品中的氧气，防止产品氧化变质，防止微生物生长， 延长食品保存期； 溶菌酶：可防止细菌污染，起保鲜作用等。
果胶酶的作用机理
酯化的半乳糖醛酸
柚苷（柚配质-7-芸香糖苷） 橙皮苷（橙皮素-7-芸香糖苷）
四、改善食品的品质和风味
风味酶的发现和应用，在食品风味的再现、强化和矫正 方面有广阔应用前景。例如： 用洋葱风味酶处理甘蓝等蔬菜； 用奶油风味酶（脂肪酶）作用于含乳脂的巧克力、冰 淇淋、人造奶油等食品； 端肽酶水解苦味肽消除苦味； 风味酶用于恢复甚至强化原来的天然风味。
面包制造中，面团中添加适量的-淀粉酶和蛋白酶，可 缩短面团发酵时间，面包品质也有提高。
第八章 酶的定向进化
定向进化与自然进化的异同 点
定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长
•
只需几年、甚至几天； 超越生物学意义的要
定向进化的应用
目标酶
卡那霉素核苷基 转移酶 枯草杆菌蛋白酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性
方法
定位诱变+选择 易错PCR+选择
结果
在60-50℃酶半衰期 增加200倍 在60％二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 对cefotaxime的抗性 增加32000倍 活力增加60-150倍
• 优点：简便，随机的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征： • ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变； • ②重组可伴随点突变同时发生； • ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 • 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
生物多样性：整个生态系统中的生物
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出 酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
第八章酶免疫技术
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
第八章酶工程
第八章酶工程
按现代观点，酶工程主要包括以下内容 ① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 新颖酶的发现、研究和应用 ③ 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ④ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ⑤ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 ⑥ 有机介质中酶的反应 ⑦ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑧ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑨ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究
第八章-酶工程
2023/12/28
第八章酶工程
酶工程
一． 概述 二． 酶的命名和分类 三． 酶的化学本质、来源和生产 四． 酶催化反应机理及反应动力学 五． 酶的固定化和固定化酶反应器 六． 酶工程的应用 七． 酶工程的研究进展
第八章酶工程
一 酶和酶工程的概述
（一）、 酶的概念 （二）、 对酶的认识和研究历程 （三）、 酶工程的概念
通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法 培育出新的高产酶的菌株。
第八章酶工程
微生物细胞产生的酶分类 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达， 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是
该酶所催化反应的底物或产物。 一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变
为高产酶的菌株。其方法包括 ① 物理诱变育种 ② 化学诱变育种 ③ 基因工程构建
第八章酶工程
3）发酵条件控制 营养条件 环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值 特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪
切力下，蛋白质容易失活。 注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，
大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条 件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。 因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。
第八章酶工程
按现代观点，酶工程主要包括以下内容 ① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 新颖酶的发现、研究和应用 ③ 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ④ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ⑤ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 ⑥ 有机介质中酶的反应 ⑦ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑧ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑨ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究
第八章-酶工程
2023/12/28
第八章酶工程
酶工程
一． 概述 二． 酶的命名和分类 三． 酶的化学本质、来源和生产 四． 酶催化反应机理及反应动力学 五． 酶的固定化和固定化酶反应器 六． 酶工程的应用 七． 酶工程的研究进展
第八章酶工程
一 酶和酶工程的概述
（一）、 酶的概念 （二）、 对酶的认识和研究历程 （三）、 酶工程的概念
通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法 培育出新的高产酶的菌株。
第八章酶工程
微生物细胞产生的酶分类 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达， 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是
该酶所催化反应的底物或产物。 一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变
为高产酶的菌株。其方法包括 ① 物理诱变育种 ② 化学诱变育种 ③ 基因工程构建
第八章酶工程
3）发酵条件控制 营养条件 环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值 特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪
切力下，蛋白质容易失活。 注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，
大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条 件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。 因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。
第八章酶工程
酶的化学本质和作用特点
位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。
活性中心外的必需基团
01
02
03
04
05
底 物
活性中心以外的必需基团
结合基团
催化基团
活性中心
靠近效应
定向效应 锁钥学说 诱导嵌合学说 张力作用 酸碱催化作用 共价催化作用
1
2
酶作用的辅助因素
底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变” ，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。
酶 活 性
0.5
1.0
2.0
1.5
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
温度对淀粉酶活性的影响
pH对酶促反应的影响
1.最适pH
2.pH稳定性
表现出酶最大活力的pH值
在一定的pH范围内酶是稳定的
pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。
S
P
（1）
（2）
由于酶催化的反应（2）的能垒比没有酶催化的反应（1）要低，反应（2）所需的活化能亦比（1）低，所以反应速度加快。
反应总能量改变
非催化反应活化能
酶促反应 活化能
一般催化剂催 化反应的活化能
能 量
反 应 过 程
底物
产物
酶促反应活化能的改变
“张力”和“形变” ：
临近定向效应：
在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度； 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。酶作用的辅助因素3
生物化学(第三版)第八章 酶通论课后习题详细解答 复习重点
第八章酶通论提要生物体内的各种化学变化都是在酶催化下进行的。
酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。
酶的化学本质除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白质。
根据酶的化学组成可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质是由不表现酶活力的脱辅酶及辅因子（包括辅酶、辅基及某些金属离子）两部分组成。
脱辅酶部分决定酶催化的专一性，而辅酶（或辅基）在酶催化作用中通常起传递电子、原子或某些化学基团的作用。
根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。
按规定每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。
酶对催化的底物有高度的选择性，即专一性。
酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。
酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性两种类型。
用“诱导契合说”解释酶的专一性已被人们所接受。
酶的分离纯化是酶学研究的基础。
已知大多数酶的本质是蛋白质，因此用分离纯化蛋白质的方法纯化酶，不过要注意选择合适的材料，操作条件要温和。
在酶的制备过程中，没一步都要测定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯的效果。
酶活力是指在一定条件下酶催化某一化学反应的能力，可用反应初速率来表示。
测定酶活力及测酶反应的初速率。
酶活力大小来表示酶含量的多少。
20世纪80年代初，Cech和Altmsn分别发现了某些RNA分子具有催化作用，定名为核酶（ribozyme）。
有催化分子内和分分子间反应的核酶。
具有催化功能RNA的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念。
根据发夹状或锤头状二级结构原理，可以设计出各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物将会有良好的应用前景。
抗体酶是一种具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。
第八章-血清酶类测定
ALT速率法测定中酶偶联反应式为：
ALT
L-丙氨酸+α-酮戊二酸 L-谷氨酸 + L-丙酮酸
LD
丙酮酸 + NADH + H+
L-乳酸 + NAD+
上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测 吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-△A／min)，计算出ALT的活 性浓度。
肝硬化
ALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害 程度相一致。对ALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是 静止性肝硬化，则ALT维持正常 ；肝硬化病人的转氨酶出现较大 幅度的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。
肝癌
80%—90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALT是否 增高主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常， 因为肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALT没有释放出来，因此， ALT没有升高，或ALT有轻度或中度增高。
[参考区间]
速率法： 男性：5～40 U/L 女性：5～35 U/L
[临床意义]
ALT广泛分布于全身各组织器官，尤以肝细胞中含量最 多，其次是肾脏、心脏及骨骼肌，通常只有极少量释放入 血液，所以血清中此酶的活力很低，当这些组织病变时， 细胞坏死或通透性增加，细胞内酶大量释放入血，使血清 中该酶活力显著增高。
标本（血清或血浆）
临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和储存等一系列处理过程。 而酶在血中处于一个动态变化过程，血液离开机体后还会有一定变化。 因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。
标本应避免溶血：
大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多 ，少量 血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞 内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7 倍左右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。
第八章酶在果蔬类食品生产中的应用
研究表明，用果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶处理 苹果汁有很好的效果，但大部分商品酶对柠檬 汁、酸橙汁等pH值低的果汁的澄清作用不理想， 原因主要是过低的pH值抑制了酶的活性，研究 发现利用酶作用的产物即聚半乳糖醛酸可以起 到澄清作用。
固定化多酶系统（果胶酶、淀粉酶）
现在的研究趋向是使用固定化的多果胶酶系统 讲行果汁澄清，这些酶中包括降低果汁粘度、 降解果实组织的酶，甚至包括除去果汁中淀粉 的淀粉酶系统，因为一般果汁中都含有一些淀 粉，这些淀粉的存在会引起贮藏过程中果汁的 混浊，必须除去。
基因枪原理
导入ACC合成酶反义基因的番茄
Hamilton等于1990年首次构建了ACC氧化酶反 义RNA转基因番茄，在纯合转基因番茄果实中， 乙烯的合成被抑制了97%，从而使果实的成熟 延迟，贮藏期延长。导入ACC合成酶反义基因 的番茄也得到了类似的结果。转基因番茄的乙 烯合成也被抑制了99.5%，果实中不出现呼吸 跃变，叶绿素降解和番茄红素合成也都被抑制。 果实不能自然成熟，不变红，不变软，只有用 外源乙烯处理6天后才能使转基因番茄正常成 熟。因此，利用反义基因技术可以成功的培育 耐贮藏果蔬。
8.3 控制酶的基因表达进行果 蔬保鲜
控制果实成熟的酶
促进果实和器官衰老是乙烯最主要的生理功能。 在果实中乙烯生物合成的关键酶主要是乙烯在 直接前体—1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACC 合成酶)和ACC氧化酶。在果实成熟中这两种 酶的活力明显增加，导致乙烯产生急剧上升， 促进果实成熟。
基因技术控制酶的表达
在对这两种酶基因克隆成功的基础上，可以利 用反义基因技术抑制这两种基因的表达，从而 达到延缓果实成熟，延长保质期的目的。利用 反义RNA技术抑制酶活力已有许多成功的例子， 其中最成为成功的就是延缓成熟和软化的反义 RNA转基因番茄。
第八章酶的定向进化
改进方法
其它改组方法
交错延伸重组( 交错延伸重组 StEP : Stagger extension process) 随机引物体外重组( 随机引物体外重组 RPR: Random2priming in vitro recombination) 临时模板随机嵌合生长( 临时模板随机嵌合生长 RACHITT : Random chimeragenesis on transient templates)
定向进化的历史
1 萌芽阶段 首先在分子水平上进行改造 单一分子的是 Sol Spiegelman在20世纪60年代,利用RNA噬 菌体Q进行的试验,目的是证明达尔文的自然 选择也可在非细胞体进行. 病毒基因组 Q复制酶扩增 DNA突变库 复制快的保留(能被Q酶选择识别的)
2奠基阶段
1981年,Hall B G等报道了他们定向改变了 大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专 一性,开发出对几种糖苷键有水解能力的酶. HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌, 分别在含有某种碳源的培养基上培养.从酶 的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖, 乳果糖,乳糖酸的突变酶,而野生型的酶不 能水解这些底物.
第八章 酶的定向进化
8.1 简介
通常可通过两条途径获得具有新功能和特性 的酶 一是从大量未知的生物种系中寻找; 二是改造现有已知的酶.
人工改造之定点突变
首先分析蛋白质的三维空间结构,搞清结构 与功能的关系,然后采用定点突变技术改变 蛋白质中的个别氨基酸残基,从而得到新的 蛋白质,理性化设计. 定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性,抗 氧化性,底物特异性,热稳定性及拓宽酶反 应的底物范围,改进酶的别构效应等进行了 成功的改造.
实例
Stemmer 等从不同种微生物中选择编码头孢 菌素酶的4 个同源基因, 对它们进行单独进化 和同源重组进化, 来对这两种进化模式进行比 较.在对单基因进化得到的突变酶中, 对头孢 羟羧氧胺的抗性最高的增加了8 倍, 而采用 Family shuffling 的方法使抗性比其中两种微 生物来源的天然酶提高270 倍, 比另两种酶提 高了540 倍.
第八章.酶卫生安全
酶制剂来源安全性的评估标准
1.来自动植物可食部位即传统上作为食品 成份，或传统上用于食品的菌种所生产 的酶，如符合适当的化学与微生物学要 求，即可视为食品，而不必进行毒性试 验。
酶制剂来源安全性的评估标准
2. 由非致病的一般食品污染微生物所产 的酶要做短期毒性试验。 3. 由非常见微生物所产生的酶要做广泛 的毒性试验，包括老鼠的长期喂养试验。 这一标准为各国酶的生产提供了安全性 评估的依据。
• 啤酒工业用糖化酶可增加发酵度、缩短 糖化时间。 • 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、真菌蛋白酶 等可分解肌肉结缔组织的纤维蛋白，这 些酶用于嫩肉。 • 谷氨酰胺转移酶用于增强面条的筋力、 碎肉粘合等。
• 总之酶制剂在种、简 化原有生产工艺、增加产品产量、改善 产品质量、降低原材料消耗、降低劳动 强度并消除环境污染等。
四.酶制剂安全性评价
对酶制剂产品的安全性要求，联合国粮 农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食 品添加剂专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food additives，JECFA)早在1978年 WHO第2l届大会就提出了对酶制剂来源 安全性的评估标准。
3.我国食品用酶制剂的管理现状
• 在我国食品工业用酶制剂按食品添加剂进行管理。 目前规定，使用生产酶制剂的微生物，必须提供 权威机构出具的菌种鉴定报告、毒力试验报告等 安全性评价资料。 • 截止到2002 年，已列入《食品添加剂使用卫生 标准》中的酶制剂有19 种。随着生物技术在我 国的发展，将有越来越多的经基因工程改造的微 生物用于生产酶制剂。 • 目前的当务之急是应根据酶制剂生产的特点，尽 快制定有针对性的，特别是针对生产菌株的安全 性评价程序和管理办法，以保证其使用安全，保 障消费者健康。
第八章 现代酶工程技术
Flash1
(四） L-苹果酸生产
L—苹果酸是一种重要的有机酸， 在医药和食品工业中有广泛用途。L— 苹果酸生产途径有（1）用葡萄糖直接 发酵：（2）用延胡索酸为原料酶法合 成；目前国内L—苹果酸工业化生产主 要是用延胡索酸为原料的酶法合成。普 遍使用的包埋载体是卡拉胶（K— carrageenan）。
•
三、 固定化酶技术 （一）固定化技术概述 （二）酶和菌体固定化技术 （三）固定化细胞的反应器
☆
（一）固定化技术概述
• 概说：酶已广泛应用工业及家庭日常生活 中。如 • 1、淀粉酶都采用酸解法，现在很多都用 酶解法。家庭所用甜酒药就是根霉。我们 知道还有 • 2、蛋白酶（如酱油、豆腐乳等）； • 3、果胶酶（如酒类澄清、白莲脱皮）； • 4、脂肪酶（如皮毛脱脂）等。
2．酶促效率明显提高 和固定化酶不同，菌体细胞在固定 化过程中通常不损伤细胞本身，细 胞内的酶系统也最大限度地保持着 天然状态，因此它具有较高的酶促 效率。
3．热稳定性增强 如恶臭假单孢菌经包埋后 最适反应温度较游离细胞提高 20℃，而且热稳定性也增强。
4．易产生副反应
微生物菌体细胞内含有庞大而复杂的酶系 统，其中一些酶在生产时是我们不需要的， 某些酶甚至是有害的，它们可催化生产影 响产品质量的物质。如包埋黄色短杆菌 （产延胡索酸酶）生产L—苹果酸时，便有 副产物琥珀酸产生，它是影响产品出口的 主要因素。生产上一般采用胆汁酸处理固 定化细胞，可显著降低琥珀酸的含量。
（四）菌体包埋 （1）卡拉胶熔化 生理盐水500Kg，卡拉胶20Kg， 加入1.5m3的搪瓷罐中，开搅拌， 夹套加热，升温到100℃，保温 10min，卡拉胶彻底熔化。降温到 50℃，夹套保温备用。
（四）菌体包埋 （2）混合 湿菌体114Kg，加100Kg生理盐水 放另一搪瓷罐中混匀，保温45℃， 然后压入卡拉胶罐中，恒温45℃， 搅拌10min。
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第八章酶应用
8.1 酶在医药方面的应用
用酶进行疾病的诊断 用酶进行疾病的治疗 用酶制造各种药物
第八章酶应用
1、通过酶活力变化进行疾病诊断
酶 淀粉酶 胆碱酯酶 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 谷丙转氨酶/谷草转氨酶 γ-谷氨酰转肽酶（γGT） 醛縮酶 胃蛋白酶 磷酸葡糖变位酶 乳酸脱氢酶 端粒酶 山梨醇脱氢酶（SDH） 脂肪酶 肌酸磷酸激酶（CK） α－羟基丁酸脱氢酶 磷酸己糖异构酶 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 乳酸脱氢酶同工酶
第八章酶应用
酶是生物学有力的研究工具
基因工程工具酶 基因组学 蛋白组学
第八章酶应用
酶和工农业生产与医学实践有着密切的关系
工业用酶：淀粉糖业 农业用酶：饲料 医疗用酶：蛋白酶 检测试剂 抗病毒等新药物开发
第八章酶应用
Contents of chapter 8
Go 1、酶在医药方面的应用 Go 2、酶在食品方面的应用 Go 3、酶在轻工、化工方面的应用 Go 4、酶在环境保护中的应用 Go 5、酶在生物技术方面的应用
Chapter 8 The application of enzyme
酶的应用
第八章酶应用
制作：郑穗平
第八章酶应用
“绿色健康，“酶”力无限
医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食 品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、 和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和 化工等工业领域
第八章酶应用
测定脑脊液中谷氨酰胺的量， 诊断肝昏迷、肝硬化
测定胆固醇含量，诊断高血脂等
通过基因扩增，基因测序， 诊断基因变异、检测癌基因
第八章酶应用
苯丙氨酸代谢途径关系到三种遗传病
PKU苯丙酮尿症 脑发育受阻，严重脑 力呆滞，智商 0－50
第八章酶应用
体检表中有关酶的选项
第八章酶应用
3、酶在疾病治疗方面的应用
链激酶
链球菌
治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折
青霉素酶
蜡状芽孢杆菌
治疗青霉素引起的变态反应
L-天冬酰胺酶 大肠杆菌
治疗白血病
超氧化物歧化酶 微生物，植物，动物
预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎
凝血酶
动物，蛇，细菌，酵母等 治疗各种出血病
胶原酶
细菌
分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡
右旋糖酐酶
葡萄糖氧化酶 亮氨酸氨肽酶（LAP）
疾病与酶活力变化 胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降 肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降 前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高 佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降 肝病、心肌梗塞等，活力升高 原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中 酶活力升高 急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高 胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降 肝炎、癌症，活力升高 肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力正常 癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性 急性肝炎，活力显著提高 急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高 心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高 心肌梗塞、心肌炎，活力增高 急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞、急性肾炎，脑溢血，活力明显升高 急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明显升高 心肌梗塞、恶性贫血，LDH1增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌， LDH3增高；转移性肝癌、结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、外伤、 骨折，LDH5增高 测定血糖含量，诊断糖尿病
第八章酶应用
肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高
2、用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断
酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶+过氧化物酶 尿素酶 谷氨酰胺酶 胆固醇氧化酶 DNA聚合酶
测定的物质 葡萄糖 葡萄糖 尿素 谷氨酰胺 胆固醇 基因
用
途
测定血糖、尿糖，诊断糖尿病 测定血糖、尿糖，诊断糖尿病
测定血液、尿液中尿素的量， 诊断肝脏、肾脏病变
1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁 女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因 有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全， 只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这 种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的 基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。
酶参与了生物体内所有的生命活动和生命过程
执行具体的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血 酶等
清除有害物质,起保卫作用-过氧化物酶，朝氧化物岐 化酶等
协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换,传递 与放大作用,调节生理功能-蛋白激酶
催化代谢反应,建立各种各样代谢体系与代谢途径-葡 萄糖、氨基酸、核酸代谢
酶
名
来
源
用
途
淀粉酶
胰脏、麦芽、微生物
治疗消化不良，食欲不振
蛋白酶
胰脏、胃、植物、微生物 治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组 织，促进创伤愈合，降低血压
脂肪酶
胰脏、微生物
治疗消化不良，食欲不振
纤维素酶
霉菌
治疗消化不良，食欲不振
溶菌酶
蛋清、细菌
治疗各种细菌性和病毒性疾病
尿激酶
人尿
治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血
微生物
预防龋齿
胆碱酯酶
细菌
治疗皮肤病，支气管炎，气喘
溶纤酶
蚯蚓
溶血栓
弹性蛋白酶胰脏Fra bibliotek治疗动脉硬化，降血脂
核糖核酸酶 尿酸酶
胰脏 牛肾
抗感染，祛痰，治肝癌 第治八疗章痛酶风应用
溶菌酶
第八章酶应用
栓溶酶类与心血管疾病
第八章酶应用
第八章酶应用
凝血酶
消化酶类
健美生消化酶—帮助肠胃蠕动 【产品规格】90片／瓶 【食用方法】成人每日3片，随主餐服用 【成分(每片含)】 1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30
毫克； 2)消化脂肪：脂肪酶30毫克； 3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克； 4)消化乳制品：乳糖酶30毫克； 5)消化纤维：纤维素酶15毫克。 另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃
薄荷叶和茴香 【适用人群】 ·消化不良者 ·肠胃疾病患者 ·大病初愈者
第八章酶应用
SOD
第八章酶应用
美国医学家W·F·安德森等人对腺 苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的 基因治疗，是世界上第一个基因治 疗成功的范例。
8.1 酶在医药方面的应用
用酶进行疾病的诊断 用酶进行疾病的治疗 用酶制造各种药物
第八章酶应用
1、通过酶活力变化进行疾病诊断
酶 淀粉酶 胆碱酯酶 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 谷丙转氨酶/谷草转氨酶 γ-谷氨酰转肽酶（γGT） 醛縮酶 胃蛋白酶 磷酸葡糖变位酶 乳酸脱氢酶 端粒酶 山梨醇脱氢酶（SDH） 脂肪酶 肌酸磷酸激酶（CK） α－羟基丁酸脱氢酶 磷酸己糖异构酶 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 乳酸脱氢酶同工酶
第八章酶应用
酶是生物学有力的研究工具
基因工程工具酶 基因组学 蛋白组学
第八章酶应用
酶和工农业生产与医学实践有着密切的关系
工业用酶：淀粉糖业 农业用酶：饲料 医疗用酶：蛋白酶 检测试剂 抗病毒等新药物开发
第八章酶应用
Contents of chapter 8
Go 1、酶在医药方面的应用 Go 2、酶在食品方面的应用 Go 3、酶在轻工、化工方面的应用 Go 4、酶在环境保护中的应用 Go 5、酶在生物技术方面的应用
Chapter 8 The application of enzyme
酶的应用
第八章酶应用
制作：郑穗平
第八章酶应用
“绿色健康，“酶”力无限
医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食 品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、 和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和 化工等工业领域
第八章酶应用
测定脑脊液中谷氨酰胺的量， 诊断肝昏迷、肝硬化
测定胆固醇含量，诊断高血脂等
通过基因扩增，基因测序， 诊断基因变异、检测癌基因
第八章酶应用
苯丙氨酸代谢途径关系到三种遗传病
PKU苯丙酮尿症 脑发育受阻，严重脑 力呆滞，智商 0－50
第八章酶应用
体检表中有关酶的选项
第八章酶应用
3、酶在疾病治疗方面的应用
链激酶
链球菌
治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折
青霉素酶
蜡状芽孢杆菌
治疗青霉素引起的变态反应
L-天冬酰胺酶 大肠杆菌
治疗白血病
超氧化物歧化酶 微生物，植物，动物
预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎
凝血酶
动物，蛇，细菌，酵母等 治疗各种出血病
胶原酶
细菌
分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡
右旋糖酐酶
葡萄糖氧化酶 亮氨酸氨肽酶（LAP）
疾病与酶活力变化 胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降 肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降 前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高 佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降 肝病、心肌梗塞等，活力升高 原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中 酶活力升高 急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高 胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降 肝炎、癌症，活力升高 肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力正常 癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性 急性肝炎，活力显著提高 急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高 心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高 心肌梗塞、心肌炎，活力增高 急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞、急性肾炎，脑溢血，活力明显升高 急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明显升高 心肌梗塞、恶性贫血，LDH1增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌， LDH3增高；转移性肝癌、结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、外伤、 骨折，LDH5增高 测定血糖含量，诊断糖尿病
第八章酶应用
肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高
2、用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断
酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶+过氧化物酶 尿素酶 谷氨酰胺酶 胆固醇氧化酶 DNA聚合酶
测定的物质 葡萄糖 葡萄糖 尿素 谷氨酰胺 胆固醇 基因
用
途
测定血糖、尿糖，诊断糖尿病 测定血糖、尿糖，诊断糖尿病
测定血液、尿液中尿素的量， 诊断肝脏、肾脏病变
1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁 女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因 有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全， 只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自 己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这 种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的 基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的 治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。
酶参与了生物体内所有的生命活动和生命过程
执行具体的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血 酶等
清除有害物质,起保卫作用-过氧化物酶，朝氧化物岐 化酶等
协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换,传递 与放大作用,调节生理功能-蛋白激酶
催化代谢反应,建立各种各样代谢体系与代谢途径-葡 萄糖、氨基酸、核酸代谢
酶
名
来
源
用
途
淀粉酶
胰脏、麦芽、微生物
治疗消化不良，食欲不振
蛋白酶
胰脏、胃、植物、微生物 治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组 织，促进创伤愈合，降低血压
脂肪酶
胰脏、微生物
治疗消化不良，食欲不振
纤维素酶
霉菌
治疗消化不良，食欲不振
溶菌酶
蛋清、细菌
治疗各种细菌性和病毒性疾病
尿激酶
人尿
治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血
微生物
预防龋齿
胆碱酯酶
细菌
治疗皮肤病，支气管炎，气喘
溶纤酶
蚯蚓
溶血栓
弹性蛋白酶胰脏Fra bibliotek治疗动脉硬化，降血脂
核糖核酸酶 尿酸酶
胰脏 牛肾
抗感染，祛痰，治肝癌 第治八疗章痛酶风应用
溶菌酶
第八章酶应用
栓溶酶类与心血管疾病
第八章酶应用
第八章酶应用
凝血酶
消化酶类
健美生消化酶—帮助肠胃蠕动 【产品规格】90片／瓶 【食用方法】成人每日3片，随主餐服用 【成分(每片含)】 1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30
毫克； 2)消化脂肪：脂肪酶30毫克； 3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克； 4)消化乳制品：乳糖酶30毫克； 5)消化纤维：纤维素酶15毫克。 另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃
薄荷叶和茴香 【适用人群】 ·消化不良者 ·肠胃疾病患者 ·大病初愈者
第八章酶应用
SOD
第八章酶应用
美国医学家W·F·安德森等人对腺 苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的 基因治疗，是世界上第一个基因治 疗成功的范例。