氨基酸类神经递质含量测定

❖ 方法2【高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】
美国 waters 2695 高效液相色谱仪、UV检测器及 色谱数据处理系统。
色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4 .6×200nm， 5μm)；流动相A 为醋酸钠缓冲液，B为乙睛-水。柱 温：28℃，进样量20μL，采用外标法定量。
Agilent 1100 高效液相色谱仪；G1321A荧光检测 器
色谱条件：Zorbax Eclipse AAA C18柱色谱柱； 75×4. 6 mm，3. 5μm；流动相A为NaH2PO4·H2O缓 冲液；流动相B为乙腈/甲醇/水，梯度洗脱。
DAD检测波长：紫外波长338 nm；FLD检测波 长：激发波长340 nm，发射波长450 nm。
一、样品处理
❖ 方法1【高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】 脑组织称重，加入 9倍体积的甲醇/水，冰浴匀
浆；离心，上清液低温保存。 衍生化反应：小脑组织液加入乙睛，混匀离心，
取上清液加入 NaHCO3和2,4 -二硝基氟苯，混匀， 暗中衍生 (水浴 65 ℃ )，进样。
❖ 方法2【反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质】
色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX C18柱 (4.6 mm× 150mm，5μm)，采用梯度洗脱。流动相 A为甲醇，流动相B为醋酸钠缓冲液。柱温30℃，进 样量20μL。
荧光检测波长：激发光波长为 340 nm，发射光 波长为 450 nm。
0 . 625-5μmol /L浓度范围内线性关系良好
荧光检测波长：激发波长为340 nm，发射波 长为 455 nm。
在 0.5-40μmol/L 浓度范围有较好的线性关系
❖ 方法6【大鼠脑纹状体微透析法研究天王补心方剂中桔梗的应用…】
检出限：Asp，Glu 为0.46μg GABA，Gly 为0.23μg
Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent l046A荧光检测器
❖ 方法5【反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】
检测限Asp、 Glu和 GABA为 0. 01μmol/ L，Gly为 0. 02μmol/ L。
Agilent 1100 高效液相色谱仪，荧光检测器配 备 3D 色谱工作站。
色谱条件：色谱柱为 Hypersil ODS C18 (4. 6 ×250mm，5μm，日本 GL 公司)，流动相：磷 酸二氢钾缓冲液/ 甲醇/乙腈，柱温 40 ℃。
VARIAN Prostar 325 紫外检测器。
色谱条件 ：反相色谱柱(ZORBAX XDB C18 4.6×250 mm，5μm , Agilent) 。流动相 A : 醋酸 钠-乙腈溶液；流动相 B :乙腈-水溶液，进样量 20μL。
紫外检测波长 254 nm。
氨基酸含量在 0.027-0.6312 mg/ml 线性关系良好
❖ 方法3【高效液相色谱法快速测定氨基酸类神经递质】
脑组织称重，加入高氯酸匀浆，精确加入内 标液，混匀低温离心，上清液备用。
衍生化反应：上清液加入KHCO3和丹酰氯丙 酮溶液，混匀置于 80 ℃水浴下 30 min，出后 加醋酸丙酮溶液终止反应，冷却进样。
❖ 方法4【发育期大鼠海马氨基酸类神经递质的研究】
衍生化反应：组织液60 ℃加热并 N2吹干，取 出后加入盐酸正丁醇，60 ℃衍生化反应 30 min。 60 ℃ 加热并 N2吹干，残渣用甲醇-醋酸铵水溶液 溶解，过滤后待用。
二、测试方法
❖ 方法1【高效液相色谱荧光法同时测定小鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质 】
液相色谱仪系统：购自日本岛津，RF-10AXL荧光 检测器
线性范围为 4.5-1000μmol/L
❖ 方法8【高效液相色谱-质谱-质谱法测定脑组织中氨基酸类神经递质】
Agilent 1100 高效液相色谱仪; 美国 ABI Q TRAP质谱仪
脑组织称重，加入无水乙醇冰上匀浆，离心 两次，将上清液过滤分装， - 70 ℃ 保存。
衍生化反应：加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液， 超声震荡摇匀，70℃ 水浴10 min，低温高速离 心20 min ,上清液尽快进样检测。
❖ 方法5【高效液相色谱 - 质谱 - 质谱法测定脑组织中氨基酸类神经递质】
脑组织称重，加入 HCl，冰浴超声粉碎, 匀浆 液加入内标，离心取上清加入甲醇，振荡 30 s， 离心，上清液备用。
色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS C18柱。 流动相为磷酸缓冲液/甲醇，梯度洗脱；柱温20℃。
荧光检测器：激发波长340 nm，发射波长450 nm。
Asp、Glu含量小不在线性内，主要测定GABA、Gly在0.08-1.28 mg/L线性关系良好。
方法7 ❖
【柱前在线衍生-反相高效液相色谱内标法快速测定饲料中氨基酸 】
紫外检测波长为 350 nm 。
0.01 -1的μg/mL范围内线性关系良好
❖ 方法3【高效液相色谱法快速测定氨基酸类神经递质 】
检测限Asp，Glu和Gly为0.2μg/L GABA为0.5μg/L
LC-10AD高效液相色谱仪，RF- 530荧光检测 器。
色谱条件：色谱柱为 Kromasil C18 (4.6 ×250 mm，5μm) ；流动相为甲醇/醋酸钠。进样量 20μL；柱温为室温。
脑组织称重，加入生理盐水，冰浴匀浆；离心
取上清液，加高氯酸，同时加内标，混匀离心， 取上清液，加K2CO3 溶液，离心，上清液备用。
衍生化反应 ：预处理好的样品加入OPA衍生液 混匀 ，室温静置，进样。由于氨基酸荧光衍生产 物不稳定 ，尤其是 Gly和 GABA ，故在衍生化时 需严格控制反应时间。
荧光检测波长：激发波长为 360 nm；发射波 长为 500 nm。
1-200 mg/L范围内各组分线性关系良好
❖ 方法4【发育期大鼠海马氨基酸类神经递质的研究 】
检测限 Glu=10.5 μg/mL,Asp=16.3μg/mL,GABA= 10.6μg/mL,Gly=8.8μg/mL
VARIAN Prostar 210 高效液相色谱仪；