韭菜中吡虫啉和啶虫脒残留的微波处理逆固相分散法净化及液相色谱检测

韭菜中吡虫啉和啶虫脒残留的微波处理逆固相分散法净化及液
相色谱检测
作者:作者：陈黎王金芳杜鹏唐小革赵坤霞潘灿平 作者单位：（中国农业大学理学院，北京100094）来源：医学期刊/ 基础医学与生物医学工程
【摘要】建立了韭菜中两种烟碱类农药吡虫啉和啶虫脒残留的快速检测方法。

韭菜样本用微波炉加热处理，使酶钝化消除含硫基质干扰，然后用乙腈提取、逆固相分散净化，用反相高效液相色谱 二极管阵列检测器检测。

在0.05～2.0 mg/kg添加水平范围内，吡虫啉的平均添加回收率在95.2%～105.3%之间；相对标准偏差在0.8%～7.8%之间；啶虫脒的平均添加回收率在97.4%～108.8%之间；相对标准偏差在1.3%～8.3%之间。

本方法对吡虫啉的检出限（LOD）为0.0078 mg/kg，定量检出限（LOQ）为0.026 mg/kg；对啶虫脒的检出限为0.0075 mg/kg，定量检出限为0.025 mg/kg。

【关键词】韭菜，烟碱类农药，微波处理，逆固相分散，高效液相色谱
Determination of Imidacloprid and Acetamiprid in Leek by Reversed Ｐhase High Performance Liquid Chromatography with Microwave Treatment and Convenient Reverse Solid Phase Dispersion Clean up
CHEN Li, WANG Jin Fang, DU Peng, TANG Xiao Ge, ZHAO Kun Xia, PAN Can Ping
1（College of Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094）
2（Quality Supervision, Inspection and Analysis Center of Agro products, Ministry of Agriculture, Beijing 100083）
Abstract A rapid method has been developed for the determination of two neonicotinoid insecticide residues including imidacloprid and acetamiprid in leek. The samples of leek were treated with microwave to make the enzyme inactive and to eliminate the matrix interferences. Then the pretreated samples were extracted with acetonitrile, further cleaned up by reverse solid phase dispersion, and analyzed by reversed phase HPLC with diode array detector (DAD). Average recoveries of imidacloprid and acetamiprid were found in the range of 95.2%－105.3% and 97.4%－108.8% at three spiking levels from 0.05 mg/kg to 2.0 mg/kg with relative standard deviations of 0.8%－7.8% and 1.3%－8.3%, respectively. Limit of detections of imidacloprid and acetamiprid were 0.0078 mg/kg and 0.0075 mg/kg, while limit of quantifications were 0.026 mg/kg and 0.025 mg/kg, respectively.
Keywords Leek, neonicotinoid insecticide, microwave treatment, reverse solid phase dispersion, reversed phase high performance liquid chromatography
本文系国家十一五科技攻关项目（No.2006BAK02A04）和北京市科技新星计划（Ｎ
o.2005A59）资助项目
* E mail: canpingp@
1 引言
韭菜为百合科葱属多年生草本植物。

韭菜中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、钙、磷、胡萝卜素、硫胺素、核黄素、抗坏血酸等营养成分，并且有消炎杀菌作用，所含丰富的纤维素，可增进胃肠消化功能，韭菜中的挥发性精油及含硫化合物具有降低血脂的作用，对治疗冠心病及高血压也有一定的疗效[1]，是我国重要的出口创汇蔬菜品种之一。

然而，韭菜易生韭蛆，严重影响韭菜的产量和质量。

目前主要采用化学农药灌根防治韭蛆，一些菜农甚至使用禁用剧毒农药对其进行防治，造成韭菜的农药残留量严重超标。

为对韭蛆进行无公害防治，一批高效、低毒、对生态环境和非靶标生物安全的新型农药逐渐受到青睐。

烟碱类农药是一类新型高效、低毒、内吸性强、残效期长、残留量低的广谱性杀虫剂，因其高效、对人类、哺乳动物及环境安全，在市场上占有很高的份额，年销售额达到60亿欧元。

烟碱类农药包括吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺及呋虫胺，其中吡虫啉是世界上销售量最大的杀虫剂品种[2,3]。

吡虫啉、啶虫脒均是通过引入2 氯 5 吡啶甲基杂环结构构建的，其作用机理是作用于神经结合部后膜，通过与胆碱受体结合使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死，具有触杀、胃毒、渗透和内吸等杀虫活性，可广泛用于水稻、棉花、蔬菜、水果等多种作物的害虫防治。

日本“食品中残留农业化学品肯定列表制度”规定吡虫啉和啶虫脒在韭菜上的最大残留限量均为5 mg/kg，其它国家尚未制定吡虫啉、啶虫脒在韭菜上的最大残留限量。

有关吡虫啉、啶虫脒在的残留分析方法，国内外已有报道，分析方法普遍存在样品前处理烦琐，费用高，使用有机溶剂量较多或基体本身的复杂性影响分析的准确度等不足。

Gupta[2]和Baskaran[3]等用高效液相色谱（HPLC）检测了茶叶、水和土壤中的吡虫啉残留量，样本的提取净化使用了液 液分配和固相萃取（SPE）；平立凤等［４］比较了多种从土壤中提取吡虫啉的方法。

文献[５～７]用SPE和液相色谱质谱联用（HPLC/MS）的方法检测了饮用水、蜂蜜、水果和蔬菜（杏、桃、梨、芹菜、小胡瓜）中的4种烟碱类农药残留。

在现有的相关报道中，前处理方法均需固相萃取柱净化（主要有C18固相萃取小柱、Al2O3层析柱、硅胶柱、Florisil和活性炭混合层析柱），且基质样本较为简单[８～1２]。

目前，国内外对于吡虫啉、啶虫脒在样品基质较为复杂的韭菜中的农药残留分析方法尚未见报道。

含辛辣气味的韭菜、葱、蒜、洋葱等是一类较特殊的蔬菜，含有硫化物，硫化物的干扰很难去除，且有很强的响应，严重干扰农药残留测定结果，是检测韭菜中农药残留的主要障碍。

最近有报道用微波处理法检测含硫蔬菜中的有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类农药残留能
有效地去除基质干扰，但其前处理用ENVI CARB/ LC NH2、PSA或Florisil固相萃取柱净化，GC ECD、GC FPD检测，操作繁琐，费用高，不利于推广[13，１４]。

本研究旨在建立一套前处理简便、快捷，既能有效消除韭菜中硫化物干扰，又具有较好灵敏度、准确度和精密度的残留分析方法，为科学控制农药使用、无公害生产韭菜、提供科学依据。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1100高效液相色谱仪，由四元低压泵、柱温箱、二级管阵列检测器（DAD）、自动进样器及Agilent色谱工作站组成（美国Agilent Technologies公司）；Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；SartoriusBP211D型电子天平（十万分之一，德国）；SartoriusBS223S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；3K15型离心机（德国Sigma公司）；Anke TDL 40B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；QL 901涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器公司）；MILLI Q 超纯水机（Millipore公司），GalanzWP800P23 K1型微波炉。

乙腈（色谱纯，Fish Scientific，Fisher ChemAlert Guide）；无水MgSO4、NaCl（分析纯，北京化学试剂公司）；PSA（初级次级胺，Agela Technologies Inc.）；吡虫啉（99.8%）、啶虫脒（96.9%）（农业部农药检定所）；混合标准溶液（两种农药用乙腈配成标准储备液，并稀释成标准工作溶液）。

超纯水。

2.2 样品前处理方法
将韭菜切成2 cm的段，称取10 g于50 mL离心管中，置于微波炉中以800 W微波处理90 s。

再将韭菜捣碎，加入10 mL乙腈，以最大速度涡旋振荡1 min，加入4 g无水MgSO4、1 g NaCl，涡旋振荡1 min，以3800 r/min离心5 min。

取1 mL上清液，加入75 mg PSA、250 mg无水MgSO4，涡旋振荡1 min，以6000 r/min离心2 min。

上清液过0.45 μm有机系滤膜于自动进样瓶中，待测。

2.3 色谱条件
流动相为V（乙腈）∶V（水）=30∶70；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：吡虫啉和啶虫脒分别采用各自最大的紫外吸收波长270和245 nm检测，进样量１０μＬ。

2.4 添加回收
将韭菜切成2 cm的段，称取10 g于50 mL离心管中，分别取0.5、5和20 mg/L混合标准溶液1 mL于10 g样本中，放置30 min，然后按照2.2中所述步骤进行处理，分别相当于0.05、0.5和2.0 mg/kg的添加水平。

待仪器稳定后，进0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、2.0和5.0 mg/L的混合标准溶液及韭
菜添加样本，分别作出吡虫啉、啶虫脒的标准工作曲线。

韭菜添加样本以保留时间对添加农药定性，标准工作曲线法定量。

3 结果与讨论
3.1 微波的作用及原理
葱蒜类蔬菜作物中含有一类含硫化合物——蒜素，以及相关的一些含硫次生代谢物。

蒜素是在蒜氨酸酶的作用下形成的，其反应底物是葱蒜类作物中的蒜氨酸类物质。

在完整的细胞内，蒜氨酸酶与底物是分隔存在的，当韭菜被切碎后，细胞受到损伤，酶与底物相遇，发生反应，产生丙酮酸、氨以及包括蒜素在内的含硫化合物[15，１６]。

迄今已从韭菜中分离鉴定出了大约20多种含硫化合物，主要是二硫化物和三硫化物[1]。

这些硫化物在常规样品前处理中很难去除，且有很强的响应，严重干扰农药残留测定结果，是韭菜中农药残留检测的主要障碍。

本实验采用微波加热钝化韭菜中的活性酶，抑制相关硫化物的产生，因此可有效去除基质干扰的影响。

3.2 微波处理时间对农药稳定性及去除基质干扰的影响
将2 mg/L混合标准溶液放置于微波炉中，在中高火下微波0、20、40、60、90、120、180和210 s，每个时间重复2次。

研究发现，在0～210 s内，对吡虫啉、啶虫脒无影响。

取20 mg/L的混合标准溶液1 mL于10 g样本中（相当于2 mg/kg的添加水平），放置30 min，然后按照2.2中所述步骤进行处理，微波时间分别取20、30、40、50、60、70、90和120 s 进行实验，同时每个时间均做样本空白对照，每个时间重复２次。

结果表明，随着微波时间的增加，韭菜本底杂峰逐渐降低，去除基质干扰的能力加强，微波处理50 s后的效果最佳，且对吡虫啉、啶虫脒无影响。

综合评定，设定微波时间为90 s。

未经微波处理的韭菜空白色谱图1Ａ和经微波处理的韭菜空白色谱图１Ｂ。

经微波处理的韭菜加标色谱图见图2（图1和图2中，上下图分别为245和270 nm检测波长的色谱图）。

由图1可知，未经微波处理的韭菜杂峰很多，且在目标农药出峰处有明显干扰，但经微波处理后杂峰明显减小或消失，基本消除了对目标农药的干扰。

3.3 样品状态对微波效果的影响
研究表明，微波炉功率、样品大小及量的多少对消除基质干扰至关重要，要根据不同的微波功率、样品大小及量来选择微波时间。

梅文泉等[17]报道捣碎后的样品再经微波处理对消除基质干扰没有作用。

所以，本研究先将韭菜切成2 cm的段微波，然后再做捣碎处理。

3.4 吸附剂的选择及优化
3.4.1 PSA用量的优化
净化时,其它条件均不改变，分别加入25、35、50、75和100 mg PSA（回收率见表1）。

研究表明，在此用量范围内PSA对吡虫啉、啶虫脒均无吸附作用。

随着PSA用量的增加对基质干扰的去除效果无明显变化规律，但对色素的去除效果略有增强。

这可能是因为PSA的主要作用是除去样本中的极性基质杂质，如有机酸、极性色素、糖类物质等，而对硫化物的去除没有明显作用。

综合以上因素，本研究中最终将PSA用量确定为75 mg。

3.4.2 吸附剂种类的选择
净化时同时加入PSA及活性炭，结果表明，活性炭的加入有利于对色素的去除，但在去除基质干扰方面与只加PSA没有明显区别（见图1B和图3）。

因此，净化时不添加活性炭。

表1 不同PSA用量时吡虫啉和啶虫脒的回收率测定结果（略）
3.5 方法的回收率及检出限
分别配制0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、2及5 mg/L 7个不同浓度混合标准溶液，平行测定3次。

以各组分峰面积为y轴，浓度为x轴做标准工作曲线。

吡虫啉的回归方程为
y=47.84x+0.433，相关系数为0.9999；啶虫脒的回归方程为y=51.35x+0.4６，相关系数为0.9999。

在0.05～2.0 mg/kg添加水平范围内，吡虫啉的平均添加回收率在95.2％～105.3%之间，相对标准偏差在0.8％～7.8%之间；啶虫脒的平均添加回收率在97.4％～108.8%之间，相对标准偏差在1.3％～8.3%之间（添加回收率及相对标准偏差见表2）。

吡虫啉的检出限为0.0078 mg/kg，定量检出限为0.026 mg/kg；啶虫脒的检出限为0.0075 mg/kg，定量检出限为0.025 mg/kg。

满足农药残留测定中对准确度、精密度和灵敏度的要求。

表2 韭菜中吡虫啉、啶虫脒的添加回收率及相对标准偏差（略）
3.６实际样品分析
以保留时间定性，标准工作曲线法定量，用上述前处理方法对3种市售韭菜进行了检测，均未发现有吡虫啉、啶虫脒农药残留。

图4为其中一种韭菜的色谱图。

结果表明，经过微波处理可有效消除韭菜中硫化物对吡虫啉和啶虫脒检测的干扰，净化方法简单易行，快速有效。

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