实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。
然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。
因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。
一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。
常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。
其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。
细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。
二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。
耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。
由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。
目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。
1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。
该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。
常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。
2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。
通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。
当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。
药敏试验方法及细菌耐药性(药剂科2016.4.20)
4.E-TEST
以纸片扩散法的操作方法获得MIC值的一种药敏试验。 操作上有纸片扩散法的优点，结果准确性可与稀释法媲美。 缺点：昂贵
结果
五、药敏结果的判读
MIC值或抑菌环直径 药物的临界浓度（CLSI、EUCAST、FDA) 比较
临界浓度:又叫折点（breakpoint）。即根据抗菌药物 抑制细菌生长所需要的MIC结合常用剂量时在人体内 所能达到的血药浓度划分细菌对各种抗菌药物敏感 和耐药的界限。
贴纸片：手工，纸片分配器 孵育：(35±2）℃，空气或CO2
纸片扩散法
结果
纸片扩散法的特点
简便，便宜，不同层 次实验室均可正规操 作，是目前推荐的临 床试验室使用方法。 检测的是抑菌环直径 （mm)
2.肉汤稀释法
药液的准备：
256μg/ml 128 64 32 …… 0.25 0.125 0.06 13个梯度
氨
苄
阿
莫
抗菌药物
盛京医院2015年统计数据
2015 年 分 离 金 黄 色 葡 萄 球 菌 对 抗 菌 药 物 的 耐 药 率
100 80 耐 药 率 ％ 60 40 20 0
19.5 15.9 5.2 19 18.6 15.9 25 0 0 0 0.3 24 0 90.9 75
G
林
素
星
星
因
胺
素
平
29.3 21.9 26.6 20.6 8.3 35.3 35.5 36 11.7 98.3 97.9 98.4 93.4 97.4
15.8
14.5
苄 氨 氨
哌 苄
西
拉
哌
抗菌药物
盛京医院2015年统计数据
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
菌药物敏感性试验和细菌耐药性的检查
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组： 临床实验室标准化研究所（Clinical Laboratory
Standards I，CLSI）将抗菌药物分成A、B、C、U四组
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组 • A组：常规药敏试验的首选药物，应常规报告
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组
• B组：包含针对医院感染的药物，亦可作为首选药物，选择 性报告临床。 （csf、多种细菌、多部位感染、A组药物过 敏或耐药，流行病学目的向感控部门报告）
细菌耐药性的检测31细菌的耐药机制311细菌产生灭活抗生素的各种酶内酰胺酶氨基糖苷修饰酶312细菌改变药物作用的靶位青霉素结合蛋白pbp肽聚糖交联靶位改变dna拓扑异构酶313细胞膜通透性改变及对药物主动外排314细菌生物膜的形成3
内容与要求
• 抗菌药物敏感性试验适应症(了解) • 药敏试验常用抗菌药物选择与分组(了解) •TH药A敏N试K 验YO结U果表示及其临床意义 (掌握) • 细菌耐药机制及常见耐药菌检测(了解)
4.1.2 MRSA的检测 • 厚度为4mm的M-H琼脂平板 • 30μ g/d的头孢西丁纸片 • 0．5麦氏浊度的待测菌液 • 35℃培养24小时 • 结果判定：
抑菌环直径≤21mm即为MRSA 抑菌环直径≥22mm即为MSSA
4.重要耐药菌的检测
4.2 万古霉素耐药和低敏感性的葡萄球菌
• 1997年日本发现1株VISA
1.2.1 药敏试验目的： 1）为临床选用抗菌药物提供信息 2）对常见病原菌耐药状况监测，经验用药 3）评价新药的抗菌药效 4）分析医院感染流行株药敏谱，为单株流行提供依据。
1.概述
1.2 抗菌药物敏感性试验目的与适应症
细菌药敏试验及其耐药表型检测课件
药敏试验的分类
纸片扩散法
将抗菌药物纸片贴在接种了待测 菌的琼脂平板上，通过测量抑菌 圈大小来确定细菌对药物的敏感
程度。
稀释法
通过不同浓度的抗菌药物与细菌在 琼脂平板上接触，观察细菌生长情 况，以判断药物的抑菌浓度。
E-test法
将抗菌药物浓度梯度试纸贴在接种 了待测菌的琼脂平板上，根据抑菌 圈边缘与试纸条的交汇点读出最低 抑菌浓度值。
点，是临床常用的药敏试验方法之一。
04
药敏试验的结果解读
结果判读标准
敏感（Susceptible）
01
表示细菌对药物敏感，通常为≤2μg/ml或≤10μg/ml，具体标
准根据药物种类和实验方法而异。
中介（Intermediate）
02
表示细菌对药物中度敏感，通常为2μg/ml＜MIC＜10μg/ml或
某些细菌可以产生酶类，将药物分解 或灭活，从而降低或消除药物的抗菌 作用。
抗菌药物作用靶点的修饰
细菌通过增加或改变靶点蛋白的数量 或修饰状态，降低药物与靶点的结合 能力。
03
药敏试验的方法
纸片扩散法
总结词
一种常用的药敏试验方法
详细描述
纸片扩散法是一种简便、快捷的药敏试验方法，通过将含有一定浓度的抗菌药 物的纸片贴在接种了待测菌的琼脂平板上，观察细菌周围的抑菌圈大小，判断 细菌对药物的敏感程度。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课 件
目录
• 细菌药敏试验概述 • 细菌耐药性及耐药表型 • 药敏试验的方法 • 药敏试验的结果解读 • 耐药表型检测的应用 • 展望与未来发展方向
01
细菌药敏试验概述
药敏试验的定义
• 药敏试验：指通过实验室方法检测细菌对抗生素等抗菌药物的敏感程度，为临床医生提供抗菌药物选择依据的过程。
抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测
2.试验方法及结果判读
三、实验内容
1、实验材料
（1）药敏纸片： ① 用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考
拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢 西丁 ② 用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、 头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、 阿莫西林/棒酸
（2）菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；
3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验） 的检测方法及结果判读。
二、实验原理
（一）抗菌药物敏感性试验检测
（二）细菌耐药表型检测
（一）抗菌药物敏感性试验
四种方法
1、纸片琼脂扩散法（K-B法） 2、稀释法 （1）肉汤稀释法 （2）琼脂稀释法 3、E-test法 4、联合药敏试验
纸片琼脂扩散法
1.基本原理
2、试验方法
MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁 纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐 平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常 用。
头孢西丁纸片扩散法解释标准
葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测 （D-test）
1.基本原理：
对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天 然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环 内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林 霉素耐药。
2、什么叫D-test？该项检测有何意义？
2.试验方法
7
3.结果判读
用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准， 报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介 （I）还是耐药（R）。
4.注意事项
（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位； （2）菌液调配好后应在15min内接种完； （3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴
药敏纸片； （4）贴完纸片后不能再移动纸片；
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验
药敏试验耐药实验报告
药敏试验耐药实验报告1. 引言药敏试验耐药实验是一种重要的药物敏感性检测方法，用于评估细菌对药物的耐药性。
在这个实验中，我们通过药物与细菌的相互作用，确定细菌对不同药物的感受性，从而为临床合理使用抗生素提供参考。
2. 实验设计2.1 实验材料- 不同种类的细菌培养物- 不同种类的抗生素药物- 维生素和蛋白胨培养基- 培养皿和排线器- 实验室培养箱、离心机、显微镜等实验设备2.2 实验步骤1. 选择待测细菌进行预培养；2. 制备不同稀释浓度的抗生素药物溶液；3. 制备含有维生素和蛋白胨的培养基；4. 在培养皿中接种不同稀释浓度的抗生素溶液和细菌培养物，分别标记；5. 培养皿置于培养箱中以适宜的温度孵育；6. 观察培养皿中细菌生长情况，并记录结果；7. 使用排线器在耐药圈周围绘制抗生素浓度的梯度图；8. 根据抗生素浓度的梯度图分析耐药性的形成。
3. 实验结果通过药敏试验，我们观察到不同细菌对抗生素药物的感受性存在差异。
在培养皿中，对于某些细菌，抗生素溶液抑制了其生长，形成明显的抑菌区，而对于其他细菌，抗生素溶液的影响较小，细菌能够生长并形成耐药圈。
据分析，耐药圈的大小与抗生素的浓度成正比。
当抗生素浓度较高时，耐药圈较小；而当抗生素浓度较低时，耐药圈较大。
这一结果表明，细菌通过适应环境选择抗生素的浓度和类型达到耐药性。
4. 结论1. 细菌对抗生素的耐药性与抗生素的浓度和类型有关；2. 对某些细菌而言，抗生素溶液能够抑制其生长并形成明显的抑菌区；3. 耐药圈的大小与抗生素浓度成正比；4. 药物敏感性检测可为临床合理使用抗生素提供参考。
5. 讨论与展望本实验利用药物敏感性检测方法评估了细菌对抗生素的耐药性，结果表明细菌的耐药性与抗生素的浓度和类型有关，这为合理选用抗生素提供了理论依据。
然而，本实验只考虑了细菌的耐药性，未考虑其他因素如表面结构或基因突变等对细菌耐药性的影响。
未来的研究可以将这些因素纳入考虑，将药物敏感性检测方法与其他手段相结合，深入探究细菌耐药性形成的机制。
抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查课件
19
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 通过靶位的改变使抗 生素不易结合，是耐药发生的重要机制。
1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红 霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺 类抗生素耐药 。
2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉 素类抗生素耐药 。
3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药 的重要机制 。
20
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变 对磺胺- 甲氧嘧啶
耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β - 内酰胺类抗生素不能结合或亲和
. K-B法试验程序
挑取菌落 转种肉汤
比浊
涂布平板上 放置药敏纸片 量取抑菌圈大1小
2
1、常见菌 2、苛氧菌 3、厌氧菌 4、酵母菌 5、真菌
. E试验法
13
. 联合药物敏感试验意义 . 联合抑菌试验 . 最低杀菌浓度测定
14
15
常用敏感性试验的方法
• 监控治疗效果试验：
• 1、血清抗菌药物浓度测定(serum antimicrobial level)
27
四、铜绿假单胞菌
• 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的 固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认 为是由于该菌具有外膜的低通透性(主要是外膜
微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质)， 最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细 菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能 同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗 过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代 敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗 生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多 采用联合治疗，如选用一种 β 内酰胺类抗生素与 一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。
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实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
（2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35℃培养16~18h，然后从平板上挑取数个菌落，于2~3ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏比浊管比浊，调整浊度与标准比浊管相同，其细菌浓度相当于108 CFU/ml。
（3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60°角，最后沿平板内缘涂抹一周，盖上平板，室温下置3~5min待琼脂表面的水分稍干。
（4）贴纸片用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板可贴4~6种药物纸片。
纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不小于15mm。
纸片一旦接触琼脂表面，就不能再移动。
（5）培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35℃培养18~24h之后观察结果。
3．结果观察和报告将平板置于黑背景的明亮处，用卡尺从背面精确测量包括纸片直径在内的抑菌环直径，测得结果以毫米为单位进行记录，最后参照NCCLS的标准（见附录）进行结果判断，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐药（resistant）等程度报告之。
4．注意事项（1）培养基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。
购买培养基时应考虑其质量，对每批M-H琼脂平板均需用标准菌株检测，合格后方可使用。
制备平板时，注意其厚度并且厚薄要均匀。
（2）药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。
药物纸片应始终保存在封闭、冷冻、干燥的环境，否则会影响其活性。
长期储存须置-20℃的冰箱，日常使用或没用完的纸片应及时放4℃保存，用时须提前1~2 h取出放室温平衡。
纸片应在有效期内使用。
（3）菌液浓度也可影响试验的结果，浓度大细菌多时抑菌环减小；菌量少时抑菌环则偏大。
此外，菌液配好后应在15min内用完。
（4）培养温度以35℃为宜。
平板的堆放不超过2块，防止受热不均。
（5）试验过程严格按要求操作，严格无菌操作。
（6）抑菌环的测量要仔细、精确。
5．质量控制：以新鲜传代的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下用与常规试验相同的方法测定对同种抗菌药物的敏感性，标准菌株的抑菌环应在预期的范围内。
如超出了该范围，则不能向临床发报告，应及时查出原因，予以纠正。
标准菌株应每周用M-H琼脂传代，4℃保存。
6．临床意义：用于临床细菌常规药敏检测，监测细菌的耐药变迁，指导临床用药。
二、试管稀释法1．原理将待测细菌种于一系列含有不同浓度抗菌药物的液体培养基中，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）。
2．方法（1）抗菌药物原液的配制：试验用的抗菌药物应为标准的粉剂，选择适宜的溶剂和稀释剂进行溶解和稀释（表7-2），并配成一定浓度（通常为1000U或1000μg/ml）的药物原液。
原液以过滤法除菌，小量分装使用，放-20℃以下一般可保存三个月，如果置4℃只能保存一周。
（2）待测菌液的准备：分纯的平板上挑取4~5个菌落，接种于3~5ml M-H肉汤中35℃培养4~6h，与标准比浊管比浊，校正菌液浓度至0.5麦氏单位之后，再用M-H肉汤按1∶200稀释，并在15min内接种。
（3）试验方法：1）排列试管：取无菌试管10~15支排列于试管架上，除第一管外，其余每管加入M-H 液体培养基1ml。
2）药物稀释：吸取抗菌药物原液（1000μg/ml）5.12ml和液体培养基4.88ml加入一无菌大试管中，充分混合后，从中吸出2ml分别加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混匀后吸出1ml加入到第三管，以此类推直至最后一管，从最后一管吸出1ml弃去；经如此稀释，各管的药物浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03μg/ml；另设培养基对照、待测菌生长对照和质控菌生长对照管。
3）细菌接种：将已准备好的菌液分别加入到上述各试验管和对照管中，每管0.05ml，轻轻旋转混匀。
4）培养：置35℃培养12~18h后观察结果。
3．结果判断及报告将试管拿出逐一对光观察，凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。
并以MIC报告之。
如果以0.01ml容量接种环从无菌生长的试管中移种一环于血琼脂平板上划线作次代培养，经35℃培养过夜后，观察能杀死99.9%的种入菌的最低药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。
4．注意事项（1）培养基的pH、渗透压和电解质均可影响试验结果。
（2）抗菌药物必须使用标准粉剂，不应使用口服药而影响其含量。
配好后的药物原液应在有效期使用。
考虑到抗菌药物的效力，不同药物应选择不同的稀释度。
（3）试验过程易污染，应严格无菌操作。
（4）结果应在12~18h内观察，培养时间过长，被轻度抑制的部分细菌可能会重新生长，由于某些抗菌药物不够稳定，时间长了其抗菌活性也会降低，甚至消失，从而使MIC 增高。
5．质量控制：每次试验应选用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下作平行试验。
如果标准菌株的试验结果超过或低于预期值一个稀释度以上，不应发出临床报告，而应找出差错的原因。
6．临床意义：多用于抗菌药物抗菌效力的测定，新药开发。
目前临床的自动化或半自动化的药敏试验多采用与次类似的微量稀释法。
三、部分细菌耐药表型的检测1．耐甲氧西林葡萄球菌的检测（头孢西丁纸片扩散法）甲氧西林(methicillin)是一种能耐青霉素酶的半合成青霉素。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一个由mec Ａ基因编码的青霉素结合蛋白（PBP2α）而对甲氧西林耐药。
这种PBP2α不但与β－内酰胺类抗生素的亲和力极低，而且具有其他高亲合力青霉素结合蛋白(PBPs)的功能。
当其他PBPs被β－内酰胺类抗生素抑制而不能发挥作用时，PBP2α可替代它们完成细菌细胞壁的合成，从而使细菌得以生存。
MRSA从1961年发现至今几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一。
因此，开展对MRSA的检测，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着十分重要的意义。
（1）原理：同纸片扩散法。
由于头孢西丁和苯唑西林较甲氧西林稳定，不易失活，通常使用这两种药物代替甲氧西林测定葡萄球菌的耐药性。
（2）方法：以无菌棉拭蘸取已调试的待测菌液接种于M-H琼脂平板上（同K-B法），再贴上头孢西丁药物纸片（30μg/片）或苯唑西林药物纸片（1μg/片），将平板置于35℃培养24h，之后观察结果。
（3）结果判断：头孢西丁纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环≥20mm为敏感，≤19 mm为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌≥25 mm为敏感，≤24 mm为耐药。
苯唑西林纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环≥13 mm为敏感，≤10 mm为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌≥18 mm为敏感，≤17 mm为耐药。
（4）注意事项：1）头孢西丁法结果观察时应使用反射光线。
苯唑西林纸片法结果需对着透射光线观察，抑菌环内有任何可辨别的细菌生长即为苯唑西林耐药。
2）培养温度应为33~35℃，超过35℃耐药的葡萄球菌可能被抑制不能生长而漏检。
2．肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶的检测超广谱β-内酰胺酶（extended -spectrum β-lactamase,ESBLs）是指能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素并扩展到能水解第三、第四代头孢菌素以及单环类抗生素并由质粒介导的β-内酰胺酶。
自1983年德国首次发现报道以来，在全世界ESBLs检出率呈现出不断上升的趋势。
并具有多重耐药和转移迅速等特点，极易导致院内交叉感染和耐药菌的扩散。
产生ESBLs的细菌主要是大肠埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、阴沟肠杆菌，其他如铜绿假单胞菌、变形杆菌属及不动杆菌属也可产生。
对ESBLs有多种方法可以进行检测，目前主要采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）所推荐的纸片扩散法、稀释法，并分筛选实验和确认实验两步进行。
（1）筛选试验（纸片扩散法）1）药物纸片：头孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片或头孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片或头孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片或头孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片）2）方法：将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于M-H琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基表面贴上头孢他啶等药物纸片（同K-B法），之后放35℃温箱中培养16-18h观察结果。