模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

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科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥Ｔ-ＤNA插入突变体的鉴定

摘要：

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中,有T-DＮＡ插入的纯合突变体,杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥Ｔ－DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有:CTAB法提取拟南芥基因组DＮＡ、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。ＰCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需２~4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。ＤＮA经EB染色,ＥＢ可与核酸结合,在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。

引言

Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的ＤNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA 中。所以Ｔｉ质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Tｉ质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-ＤNＡ区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。

T－DＮA插入基因内部导致基因突变:T-DNA插入到植物染色体上的位置是

随机的。如果T-DNＡ插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。这使农杆菌Ｔi 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。

反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DＮA插入突变体的鉴定方法。其中,“三引物法”是主要鉴定方法之一。

“三引物法”即采用三个引物(LP、ＲP、BP)进行ＰCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNＡ插入，所以其PCR扩增产物仅有1种，电泳结果为一条大带(由LP+RP这一对引物扩增出来);纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入,也只能得到1种PCR扩增产物，电泳结果为一条小带（由BＰ+ＲP这一对引物扩增出来）；杂合突变体植株只在目的基因的一

条染色体上发生了T-DＮA插入，所以PＣR扩增产物有2种,电泳结果为一条大带由（LＰ+RP这一对引物扩增出来）和一条小带（由BP+ＲP这一对引物扩增出来)。电泳结果差异明显，能有效区插入突变体的类型。

此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DＮA的插入情况。本方法操

作简单，成功率高,结果可靠，适用于从大量拟南芥T—ＤNA插入突变体中快速

鉴定出突变体。

【实验材料】

1．试剂: 液氮,2*ＣTＡＢ提取液,氯仿-异戊醇(24：1）,无水乙醇，70%乙醇，TE,ＰCＲ反应体系(DNA模板（基因组DＮA），引物LP、RＰ、ＢP,缓冲液，

MgCl２，dNＴＰmixture,ddH2O，Ｔａq酶），琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖，

1×TAE缓冲液,Ｌｏaｄｉng buffer，DＬ2,０00DNA Marｋer，λ

-Hind ⅢDNＡdigeｓt Mａrｋer，溴化乙锭。

2.器具: 1.5ｍl离心管,水浴锅，微量移液器，离心机，PCＲ仪,微波炉，电泳仪,

电泳槽，梳子，三角瓶，微量天平,手套,染色盘,凝胶成像仪。

3．材料：拟南芥Ｔ-DNA插入突变体植株。

【实验步骤】

提取拟南芥基因组DNA

1.在1．５ml离心管中放入2或3片拟南芥幼嫩叶片，用液氮将其研磨成细粉,向管中加入６00uｌ预热至65℃的2×CTAB提取液，轻摇混匀。

2. 65℃水浴30 miｎ，其间轻摇混匀。

3. 向上清液加入等体积的氯仿／异戊醇（24：１），室温下轻轻混匀10 min,12０00 rpm离心１5 min，再转移上清入新管。

4. 向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-２0 ℃下30 ｍin,1２0０0ｒpm离心１5 mｉn,弃上清。

5. 用７0%乙醇洗涤沉淀一次,１２０00 rpm稍离心,弃上清。

6. 将沉淀晾干,加20-５0ul TＥ(ｐH 8.0)，65℃水浴３0 min溶解DＮA。

PCR

取3个PＣＲ小管(一个为三引物体系,另外两个为双引物体系),按照如下反应

体系向ＰCR小管内加入样品，设定如下反应程序，进行PＣR。

反应体系:

反应程序

预变性94℃5min

变性９４℃40sec

退火53℃50sｅc

延伸7２℃80sec

循环35次

72℃10min

琼脂糖凝胶电泳

注：①电泳这一步骤，我与其余五名同学共同完成，共用同一块胶板。

②基因组DNＡ的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为０.8%，PCR产物的电泳所用琼

脂糖凝胶浓度为2%。

１. 制胶：称取0．2４g琼脂糖，加入30mｌTAE缓冲液(用于基因组DNA的电泳）；另称取1.60ｇ琼脂糖，加入80mlTAＥ缓冲液(用于ＰCR产物的电

泳）。放入微波炉中加热溶化。

２．灌胶：待胶冷至5０－6０℃时，缓缓倒入胶板。约半个３０—40min后,胶已凝固，拔去梳子，将胶板放在电泳槽中,补充槽内ＴAE缓冲液，至

约高出胶板１mm。

3．加样：将样品与Lｏading ｂｕffｅr在封口膜上混匀，用微量移液器将样品加入到点样孔内。(基因组DNＡ加样量为5ul,PCR产物加样量为２０u

ｌ)

4．电泳:接通导线（加样端接负极）,调节电压至5v／cm，当指示剂距胶板底部1-2cm时,停止电泳。

5.染色：将胶板放入含ＥB的染色盘中，染色约１０mｉn,再将胶板转移到清

水中清洗。