一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用
一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法[发明专利]
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专利名称：一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法
专利类型：发明专利
发明人：张世忠,刘琳,郑成超,马晓君
申请号：CN202010434547.8
申请日：20200520
公开号：CN111690678A
公开日：
20200922
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。
本发明所述的方法是先将携带目的基因的普通或特定载体转入发根农杆菌中，再用活化的发根农杆菌菌液侵染预培养的木本植物组培苗，培养至植株长出转基因毛状根后，转至添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中诱导根生芽，再经过扩繁生根从而获得整株转基因木本植株。
通过本发明的方法得到转基因植株的转化效率高，不仅充分利用了木本植物自身的细胞全能性，促进转基因根向整株转基因植株的分化，并且成本低，该方法适用性广，可以用于各种木本植物的转基因培育，具有广阔应用前景。
申请人：山东农业大学
地址：271000 山东省泰安市岱宗大街61号
国籍：CN
代理机构：青岛合创知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王晓晓
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杨树抗逆转录因子基因遗传转化与功能验证
杨树抗逆转录因子基因遗传转化与功能验证林木作为重要的可再生资源,对维持和保护生态环境具有重要作用,随着目前生态系统退化情况加剧情况的加剧,林木的产量和质量及森林生产力受到严重影响。
因此培育抗逆林木新品种,改良利用干旱、半干旱及盐碱荒地,推动土地资源的开发利用,改善环境资源,已经成为当前研究热点。
基因工程技术可以从基因水平上改良林木的目的性状,为林木遗传改良育种开辟新的途径。
本研究以杨树新品种凌丰2号杨（Populus×euramericana cl.?Lingfeng 2‘）为受体材料,采用农杆菌介导法首次进行三个抗逆转录因子基因——茉莉酸乙烯应答元件基因（JERF36）、锌指蛋白基因（ZxZF）、ABA响应元件结合蛋白基因（ckAREB）多组合遗传转化研究。
通过室内抗性生理测定,根系Na<sup>+</sup>、K<sup>+</sup>、H<sup>+</sup>离子流测定,定量抗逆相关基因表达,进行转基因杨树抗逆能力测定,获得抗性效果显著的转基因杨树。
本研究对多组合转录因子导入改良杨树抗性作用机制的探讨及转录因子基因在林木育种中的应用,培育高效林木基因工程新品种具有一定的理论指导意义。
论文主要研究结果如下:1.成功构建抗逆转录因子双基因载体和三基因植物表达载体。
首次将来源于强旱生灌木霸王（Zygophyllum xanthoxylum）的锌指蛋白基因（ZxZF）和柠条（Caragana Korshinskii）的ABA响应元件结合蛋白基因（ckAREB）及来源于草本植物番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的茉莉酸乙烯应答元件基因（JERF36）三个不同调控途径转录因子以多种组合方式构建到同一植物表达载体上,成功构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体（pBIJEAR）及ZxZF–ckAREB-JERF36三基因植物表达载体（pMDCZXARJE）,实现多抗逆调控基因相对稳定串联。
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法一、背景介绍1. 转基因植物简介随着生物技术的发展，转基因植物已在农业生产中得到广泛应用。
转基因植物是指将外源基因导入植物基因组，从而赋予植物新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物具有抗病虫害、耐逆境、提高产量等特点，在农业生产中具有重要的应用价值。
2. 根瘤农杆菌简介根瘤农杆菌是一种土壤中常见的细菌，它具有特殊的DNA转移酶，能够将外源基因导入植物细胞核。
根瘤农杆菌被广泛应用于制备转基因植物的过程中。
二、根瘤农杆菌制备转基因植物的方法1. 选择表达载体在利用根瘤农杆菌制备转基因植物的过程中，首先需要选择合适的表达载体。
表达载体是一种携带外源基因并能够在植物细胞内表达的载体。
常用的表达载体包括质粒和农杆菌头部。
2. 构建重组质粒将外源基因插入表达载体中，构建重组质粒。
在构建重组质粒时，需要考虑外源基因的稳定性、表达水平和对植物生长发育的影响。
3. 选择合适的宿主植物选择适合的植物作为宿主植物。
在选择宿主植物时，需要考虑植物的再生能力、组织培养条件和对外源基因的接受性。
4. 根瘤农杆菌介导的遗传转化将构建好的重组质粒介导至根瘤农杆菌中，使其在植物组织中导入外源基因。
通过适当的方法，将根瘤农杆菌转化入宿主植物细胞内，实现外源基因的导入。
5. 诱导再生植株待外源基因在植物细胞内表达后，通过诱导再生植株的方式，培养出带有外源基因的植株。
6. 筛选转基因植株通过对转基因植株进行筛选，筛选出带有目标性状的植株。
筛选过程中，通常使用抗性标记基因或荧光标记基因作为筛选标志。
7. 鉴定转基因植物对转基因植物进行鉴定，确认其确实带有外源基因并且表达稳定。
鉴定方法包括PCR、Southern blot等分子生物学技术和生化分析。
三、根瘤农杆菌制备转基因植物的优势1. 高效性根瘤农杆菌介导的遗传转化具有高效性，能够快速、准确地将外源基因导入植物细胞内。
2. 多样性根瘤农杆菌制备转基因植物的方法适用于多种植物，包括大豆、玉米、水稻等重要农作物。
转基因杨树的研究进展及应用前景
因的木 本 植物— — 杂 交 的 白杨 （ ｏｕ ｓｔｃｏａｐ Ｐ ｐｌ ｉ ｃｒａ与 Ｐ．ｅ． ｕ ｒｈ ｄ１ ｔｄｓ 交子 代 ） 这 引 起 了 人 们 对 转 基 因 树 研 究 的 极 大 兴 ｏｅ杂 ｉ ，
维普资讯
２Ｏ Ｏ ２年 第 ４期 总 １１ ４ 期
山 东 林 业 科 技
Ｓ ａ ｄ ｎ ｏ ｅ ｔ ｃｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｈ ｎ ｏ ｇ Ｆ ｒｓｒ Ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｙ
２ ２ ００
Ｎｏ． ４
１ 抗 除 草 剂 的 研 究
抗 除草 剂对 于农作 物 的生 长来说 是非 常 必 要 的 ， 草剂 除 的应用 在发 达 国家 已相 当 普 及 ，５ ～１０ 的 栽 培 作 物 上 ８％ ０％ 都 使用 着 除草 剂 （ ａ ｌｙ １９ ， Ｃ ｓ ｅ ，９４） 因此 近 几 年 抗 除 草 剂 转 基 ｅ 因树 的研究 发展 迅速 。 １８ 年 ， ９６ 在得 到 第一 株 转 基 因 白杨 后
不 久 ， 除 草剂 基 因就被 转 入杂 交 的 白杨 Ｎ 抗 Ｃ一５ ３ （ ａｂ ３ ９ Ｐ． ／ ． ａ
虫的 毒杀 效 果 并 不好 。伍 宁 丰 等 （９ １ 以欧 洲 黑 杨 为研 究 １９ ）
对 象 ， Ｂ 毒 蛋 白 基 因 导 入 叶 片 获 得 再 生 植 株 ， ｏｔｅ 杂 将 ｔ Ｓｕ ｍ ｈ 交 证 明 确 有 外 源 基 因 插 入 ， 颖 川 等 （９ ３ 用 再 生 植 株 对 杨 田 １９ ） 尺蠖 进 行 实 验 ， ５— ９ 内 死 亡 率 达 ８ ％ 一９ ％ 。 颖 等 ｄ ｏ ６ 陈 （９ ５ 用 Ｂ 基 因 转 化 美 洲 黑 杨 ，Ｃ １９ ） ｔ Ｐ Ｒ实 验 证 明 部 分 植 株 已 成 功 地 进 行 了 转 化 。 王 学 聘 等 （９５ 将 携 带 ３ ｓ １９ ） ５ —Ｑ —Ｂ —Ｎ ｓ ｔ ｏ 的嵌 和基 因导 入 欧 美 杨 ， 转 化 植 株 ， 获 ３株 转 化 植 株 对 舞 毒 蛾 杀 虫 率 为 ５ ％ 一５ ％ ， Ｃ 和 Ｓ ｕｈｒ 杂 交 ， 明 Ｂ 毒 蛋 ５ ８ ＰＲ ｏ ｔｅ ｎ 证 ｔ
【CN109679993A】一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910132872.6(22)申请日 2019.02.22(71)申请人 北京林业大学地址 100000 北京市海淀区清华东路35号(72)发明人 杨清 孟冬 董碧莹 付玉杰 牛丽丽 宋治华 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569代理人 刘奇(51)Int.Cl.C12N 15/82(2006.01)A01H 4/00(2006.01)(54)发明名称一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法(57)摘要本发明提供一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，涉及植物基因工程技术领域，本发明所述方法首先构建带有目的基因的发根农杆菌，并使植物的无菌苗生根后进行栽种，当栽种后的无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超3cm且根数多10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得毛状根转基因植物。
与常规植物转基因体系相比，本发明的方法可省去植物愈伤细胞再分化步骤，克服利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长等问题。
本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。
权利要求书1页 说明书8页序列表1页 附图2页CN 109679993 A 2019.04.26C N 109679993A权 利 要 求 书1/1页CN 109679993 A1.一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，包括以下步骤：(1)将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌；(2)将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植；(3)当植物无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部0.5～3cm处；(4)待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物；所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的限定。
一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法[发明专利]
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专利名称：一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法
专利类型：发明专利
发明人：张木清,王继华,徐世强
申请号：CN201811451201.8
申请日：20181130
公开号：CN109355307A
公开日：
20190219
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，包括以下步骤：将外源基因导入到农杆菌中，并制成转化菌液；将受体材料浸泡到转化菌液中，再将受体材料置于共培养培养基中，培养得到侵染受体材料；将侵染受体材料置于RITA的选择培养基中，同时进行抗性筛选和再生；待苗高为0.5‑1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；将生根的植株移栽，得到转基因植株。
本发明采用侵染受体广，植物叶片，愈伤组织，胚性细胞等均可为材料，通过农杆菌介导将外源基因导入植物细胞，直接通过浸没培养获得转基因植株，适合大规模的转基因批量生产。
申请人：广西大学
地址：530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学路100号
国籍：CN
代理机构：广州鼎贤知识产权代理有限公司
代理人：覃现凯
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农杆菌介导转化和再生的杨树讲解
农杆菌介导法转基因杨树摘要：杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。
叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。
致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。
没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。
然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。
NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。
这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。
关键词：白杨；转化；农杆菌前言基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。
森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。
方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。
根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。
可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。
发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化
核农学报2023，37（8）：1516~1522Journal of Nuclear Agricultural Sciences发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化吴梦洁1洪家都1李芳燕1周生财2林二培1程龙军1， *（1浙江农林大学林业与生物技术学院/亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州311300；2丽水职业技术学院，浙江丽水323000）摘要：闽楠［Phoebe bournei（Hemsl.） Yang］为我国重要的珍贵树种。
为建立闽楠遗传转化体系，以闽楠幼苗为材料，利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。
在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上，进一步利用正交［L9（33）］试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。
另外，对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。
结果表明，注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为80.0%、66.7%；而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。
正交试验中，影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。
最大诱导率和转化效率分别达到了87.5%、70.6%。
该体系的最优组合为：K599菌株在菌液浓度OD600=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。
此外，较弱光强（50 µmol·m-2·s-1）的培养条件比较强光照（100 µmol·m-2·s-1）更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。
本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系，成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株，为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。
关键词：闽楠；遗传转化；发根农杆菌DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2023.08.1516闽楠属于樟科（Lauraceae）楠属（Phoebe）植物，是我国重要的珍贵树种［1］。
一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法[发明专利]
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专利名称：一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法专利类型：发明专利
发明人：杨清,孟冬,董碧莹,付玉杰,牛丽丽,宋治华
申请号：CN201910132872.6
申请日：20190222
公开号：CN109679993A
公开日：
20190426
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，涉及植物基因工程技术领域，本发明所述方法首先构建带有目的基因的发根农杆菌，并使植物的无菌苗生根后进行栽种，当栽种后的无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超3cm且根数多10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得毛状根转基因植物。
与常规植物转基因体系相比，本发明的方法可省去植物愈伤细胞再分化步骤，克服利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长等问题。
本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。
申请人：北京林业大学
地址：100000 北京市海淀区清华东路35号
国籍：CN
代理机构：北京高沃律师事务所
代理人：刘奇
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转基因植物发根农杆菌研究的进展及应用
转基因植物发根农杆菌研究的进展及应用
熊笙屹;厍润祥;张璐;孟令晨;于月华;倪志勇
【期刊名称】《农业与技术》
【年(卷),期】2017(037)016
【摘要】农杆菌转化法作为植物基因工程使用最广泛的转化方法之一,分为根癌农杆菌Ti质粒和根瘤农杆菌Ri质粒2种类型.发根农杆菌(A gmbacterium rhiz-ogenes)的Ri质粒能够诱导植物产生毛状根.本文阐述了发根农杆菌的特性及Ri质粒的分类、结构特征和转化特点,介绍了发根农杆菌在实际生产中的应用,分析了影响发根农杆菌成功转化的因素,综述了发根农杆菌在理论研究、植物基因工程、植物品种改良、植物次生代谢产物生产和植物栽培生根等方面的应用,并指出未来领域研究的着重点.
【总页数】3页(P72-74)
【作者】熊笙屹;厍润祥;张璐;孟令晨;于月华;倪志勇
【作者单位】新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学农学院,新疆乌鲁木齐 830052
【正文语种】中文
【中图分类】Q943
【相关文献】
1.转基因植物药物的应用及研究进展
2.发根农杆菌Ri质粒rol基因研究进展及在林木改良上的应用
3.发根农杆菌的研究进展及其应用
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5.转基因植物食用疫苗研究进展及其在柑桔育种中的应用
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发根农杆菌介导的银中杨茎段遗传转化体系的建立及生理生化指标的测定
发根农杆菌介导的银中杨茎段遗传转化体系的建立及生理生化指标的测定杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）落叶乔木植物的通称,银中杨（Populus alba×P.berolinensis）是银白杨（p.alba Linn）与中东杨（P.Berolinensis Dipp.）经过杂交选育出的新型树种。
银中杨是园林绿化的优良树种之一,但其扦插生根难,育苗成活率低的特点均是银中杨育种所面临的难题。
因此,改良银中杨的性状、增加其对生存环境适应能力的意义重大。
本实验选用银中杨当年生的幼嫩枝条作为植物材料,经过外植体的取材及消毒灭菌、预培、侵染、共培、卡那霉素（Kan）筛选、PCR分子鉴定及PCR产物测序等步骤,建立了发根农杆菌介导的银中杨遗传转化体系,确定银中杨遗传转化侵染最佳菌液OD<sub>600</sub>值为0.6,最佳侵染时间为30 min,最佳外植体为茎段的上段,Kan最小致死浓度为30 mg/L,转化植株基因组经过PCR分子鉴定及PCR产物测序,初步建立了发根农杆菌介导的银中杨茎段遗传转化体系。
以银中杨转化植株为实验材料,对转化植株的株高、叶数、叶面积、茎粗、节间长度以及根系的根总长、根总表面积、根总体积、根总投影面积、根尖数、分枝数、单位平方米土壤总根长、平均根直径等形态学指标;丙二醛（MDA）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活力;净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、细胞间隙CO<sup>2</sup>浓度（Ci）、水分利用效率（WUE）等参数;光系统II的相对电子传递速率（ETR）、实际光化学量子产量（ΦPSII）、光化学淬灭（qP）、非光化学淬灭（NPQ）、PSⅡ反应中心光化学效率（Fv/Fm）、光能转化能力（Fv/Fo）等叶绿素荧光参数进行测定与分析。
形态学指标分析:转化植株株高矮化,节间变短,叶面积减小,生长速度高于同时期生长的对照植株;转化植株总根长、总根表面积、根体积、总根投影面积、根尖数、分枝数、单位平方米土壤总根长、平均根直径均大于对照植株,说明转化植株的根系庞大、侧根较多,有利于植株更好的吸收水分及养分,供给地上部分生长发育。
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一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用
一种常用的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法是利用农杆菌介导的遗传转化技术。
该方法主要包括以下步骤：
1. 构建转基因载体：首先，选择合适的载体，如农杆菌受体质粒(pCAMBIA系列)。
然后，将目标基因的编码序列插入到载
体的适当位点上，并添加合适的启动子、终止子等调控元件。
2. 农杆菌培养：接下来，将构建好的转基因载体转化到农杆菌中，将该菌株在适宜的培养基中培养至菌液浓度达到一定程度。
3. 植物杨树的样本处理：从要转化的杨树中取一些新生芽或叶片作为样本，进行消毒处理，以去除杂菌。
4. 农杆菌介导的遗传转化：将农杆菌菌液和杨树样本共同处理，可以通过浸泡法、伤口注射法或利用农杆菌耐冻性侵染方法等手段。
5. 培养和筛选转基因杨树：将处理后的样本在适宜的培养基上进行培养，待转基因杨树生长出来后，利用适当的筛选方法去除未转化的杨树细胞。
6. 鉴定转基因杨树：对转基因杨树进行PCR扩增、Southern
杂交等方法进行鉴定，确定其是否成功转化。
7. 进一步培养和繁殖：将鉴定通过的转基因杨树进行进一步培养和繁殖，以得到足够数量的转基因杨树。
转基因杨树的应用主要包括以下几个方面：
1. 抗逆性提高：通过引入耐盐、耐干旱、耐寒等抗逆基因，增强杨树对环境逆境的适应能力，提高生存率和产量。
2. 木质纤维改良：通过引入纤维素合成相关基因，增强杨树木质纤维的产量和质量，提高杨树的木材利用价值。
3. 生物能源生产：通过引入生物质降解酶的基因，增强杨树木质纤维的降解能力，提高生物能源的产量。
4. 农药抗性改良：通过引入抗虫、抗病等相关基因，提高杨树对害虫和病原体的抵抗能力，减少农药的使用。
5. 环境修复：通过引入重金属吸收、分解等相关基因，增强杨树对重金属的吸附和分解能力，用于环境修复和污染治理。
总之，农杆菌介导的转基因杨树的构建方法可以为杨树的遗传改良提供途径，具有重要的应用价值。