LBD1-30基因调控杨树茎干次生生长的功能分析

LBD1-30基因调控杨树茎干次生生长的功能分析次生生长是多年生树木木材形成的生物学基础,在此过程中形成层(vascular cambium)干细胞(stem cell)经过连续的细胞分裂和分化、细胞扩张、次生细胞壁合成以及细胞程序化死亡等过程,向外产生次生韧皮部(secondary phloem),向内产生次生木质部(secondary xylem)。目前对次生生长的研究大多集中于木质部表达量高于韧皮部的基因,对于韧皮部表达量高于木质部的基因的研究较少,本研究将以后者作为出发点,通过转基因工程来研究基因对次生生长的调控。

通过对前期的RNA-seq结果进行分析数据,我们分析了杨树茎段木质部和韧皮部的全基因表达水平,发现了LBD基因家族中在植物次生维管组织中显著差异表达的基因,并重点分析在韧皮部表达量高于木质部的基因。本研究以84K杨茎段为材料,克隆了杨树LBD1-30基因(Potri.008G043900),构建了35S:LBD1-30的过表达载体,利用农杆菌介导的转化体系,将LBD1-30基因转入84K杨,并通过表型分析和切片分析等初步验证了LBD1-30对杨树次生维管组织发育的影响,证明其对杨树次生生长具有显著的调控作用。

该研究为今后培育速生高产的杨树新品种提供了重要的现实意义和理论价值。主要研究结果如下:(1)LBD1-30基因的克隆及序列分析。

从毛果杨基因数据库中查询出LBD1-30基因的CDS序列,其包含的CDS序列总长度为666bp,编码氨基酸数量为221个。设计引物,并用84K杨茎段为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了LBD1-30基因。

比对分析测序结果,84K杨中LBD1-30的编码序列与毛果杨参考序列相比有多个单碱基突变(SNP),但是蛋白序列有着96.4%的相似度。(2)构建了

35S:LBD1-30的过表达载体,并成功地转入了84K杨中。

通过农杆菌介导的转化方法转化84K杨。将愈伤组织产生的生根转基因苗切头转入新的含有30mg/L Kana的生根培养基上再进行筛选,选择生根的转基因苗提取DNA进行PCR鉴定,最后获得转基因的阳性植株。

(3)转基因苗中LBD1-30基因的表达水平定量分析和表型分析。转基因苗中的LBD1-30基因的表达量远远高于野生型,并且不同株系之间的表达量存在明显差异。

转基因植株在表型上可分为高粗型和矮粗型,且基因表达量越高表型越倾向于矮粗型,但这种转基因株系生根慢甚至不生根,较难准备材料。高粗型株系基因表达量略低于矮粗型,但生根及生长和野生型无异,后期生长量大。

(4)LBD1-30基因对次生生长的调控。与野生型相比,LBD1-30过表达转基因苗中次生韧皮纤维木质化增加,而次生木质部木质化则被抑制,甚至出现明显的不规则木质化。

表明LBD1-30基因在次生生长过程中,对形成层干细胞的分裂增生和次生木质部/次生韧皮部的分化过程可能发挥重要的调控作用。