土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法

土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法
一、实验目的
1.学习掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征
2.学习并掌握荚膜染色法并了解荚膜的形态特征
3.学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征
4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术
二、实验原理
1.细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不
着色（芽孢呈无色透明状）。

2.芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色又难以脱色这一特点而设计的。

3.所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以
促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，
然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而更能明
显地衬托出芽孢，便于观察。

4.染色方法：改良后的Schaeffer-Fulton氏染色法
三、实验仪器及材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌
2.染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液
3.仪器或其他用具：Eppendorf管架、载玻片、显微镜、电磁炉、搪瓷杯等。

四、实验步骤
1.制备菌悬液：在EP管中滴两滴生理盐水，挑取2-3环菌苔加入到含生理盐水的EP
管中，混合均匀。

2.染色：在EP管中滴加2-3滴孔雀绿染液，盖紧EP管，将EP管插入浮筏中，放进
沸水中加热15-20分钟，加热过程需要有人看护，随时控温，防止沸水进入EP管。

3.涂片固定：取半滴经孔雀绿染色的菌悬液在载玻片的中央，用接种环将菌液涂抹均
匀，将载玻片用法电风机冷风吹干，经过酒精灯火焰固定三次。

4.脱色：待玻片冷却后，水洗脱色。

5.复染：滴加数滴0.5%番红水溶液在菌膜上，染色2min，再水洗。

6.镜检：将晾干后放在显微镜下观察。

五、实验结果
结果描述：大部分菌体被染成红色，少部分被染成绿色，说明有芽孢产生，但是芽孢的数量没有菌体多，芽孢被染成绿色，菌体被染成红色，由绿色
芽孢的外面还包裹着一层淡红色带可知，该芽孢是内生芽孢，芽孢呈椭圆形，位于菌体的中央，是中央生的芽孢，同时可以观察到枯草芽孢杆菌的大小比平常的小得多。

思考题：
（1）为什么芽孢染色需要进行加热操作？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？
答：芽孢是一种抗逆性很强的休眠体结构，与正常细胞和菌体相比，芽孢壁厚，通透性低，不易着色，用普通染色法无法对芽孢进行染色，所以不能用简单染色法观察到芽孢；芽孢一旦着色就不易脱色，利用这一特点，用染色能力强的染料在加热条件下进行染色，通过加热促进染料进入芽孢与菌体，使芽孢与菌体都可以着色。

（2）若制片中仅看到游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析其原因。

答：在用老式的Schaeffer-Fulton氏染色法进行固定时，温度太高，使营养细胞与芽孢囊破裂；还有可能是复染的时间不够，营养细胞与芽孢囊还未成功着色，故在显微镜下看不到。

（3）用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？
答：初染芽孢后玻片的温度还很高，若此时直接用冷水冲洗玻片，会使玻片破裂。