激酶检测：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例
丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理
丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理一、概述在生命科学研究中，分子生物学领域的检测试剂盒广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物筛选等方面。
丙酮酸激酶检测试剂盒是一种用来测定丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase，简称PK）活性的试剂盒。
本文将从以下几个方面介绍丙酮酸激酶检测试剂盒的测定原理：•丙酮酸激酶简介•丙酮酸激酶检测试剂盒组成•丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理二、丙酮酸激酶简介丙酮酸激酶是一种在糖酵解过程中起关键作用的酶，它能够催化丙酮酸与磷酸化物（如ADP）反应生成磷酸丙酮酸和ATP。
丙酮酸激酶广泛存在于真核生物和原核生物的细胞质中，是细胞能量代谢的重要调控因子。
三、丙酮酸激酶检测试剂盒组成一般来说，丙酮酸激酶检测试剂盒由以下几个组分组成： 1. 丙酮酸激酶底物：一种特定的丙酮酸底物。
2. 辅酶：用于促进丙酮酸激酶的催化活性。
3. PK反应缓冲液：用于维持反应环境的稳定性。
4. 酶标试剂：用于测定反应终点的标记试剂。
5. 正样品：已知浓度的丙酮酸激酶样品，用于构建标准曲线。
四、丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理丙酮酸激酶检测试剂盒测定原理基于丙酮酸激酶催化丙酮酸与磷酸化物反应的特性。
具体步骤如下：1. 样品制备将需要测定丙酮酸激酶活性的样品收集，并通过离心等方法，将样品从细胞或组织中提取出来，得到纯化的丙酮酸激酶。
2. 反应体系配置按照试剂盒说明书中的配方，将丙酮酸底物、辅酶和PK反应缓冲液按一定比例混合，制备反应底物液。
3. 样品处理将制备好的样品与反应底物液按照一定比例混合，使得反应体系达到相应的浓度。
4. 反应过程将混合好的反应物置于适当的温度下孵育一段时间，使丙酮酸激酶催化底物发生反应，生成磷酸丙酮酸和ATP。
5. 酶标反应将反应终止或稀释后的样品取出，加入酶标试剂，进行酶标反应。
酶标试剂中的特定物质与ATP反应，产生荧光或颜色信号。
6. 信号测定使用合适的光谱仪或读板仪器，测定酶标反应后的荧光或颜色信号的强度。
激酶活性测定方法
激酶活性测定方法
激酶活性测定方法是用来测量生物体内激酶酶活性的实验方法。
激酶是一种能够催化底物分子转化为产物的酶，通常通过磷酸化底物来进行催化反应。
常见的激酶活性测定方法包括：
1. 放射性测定：将激酶反应体系中的底物标记上放射性同位素，通过测量反应产生的放射性底物酶解产物，来确定激酶的活性。
2. 荧光测定：利用荧光标记的底物，通过测量反应产生的荧光强度变化来测定激酶的活性。
常见的方法有荧光共振能量转移（FRET）和荧光极化。
3. 酶促颜色反应：将激酶反应体系中的底物溶液与某种荧光标记的酶结合，通过测量荧光强度的变化来测定激酶活性。
4. 无标记测定：利用质谱等无标记技术，通过测量激酶反应产物与底物的质量比，来确定激酶的活性。
需要注意的是，选择合适的激酶活性测定方法需要考虑到底物特性、实验操作的可行性和灵敏度等因素，并且需要与其他实验数据进行比较与分析，从而得出准确可靠的结果。
激酶检测方法的最新研究进展
激酶检测方法的最新研究进展刘杨;邹笑然;李琛琛;张春阳【摘要】Kinases are a class of enZymes that catalyZe the transfer of a phosphate group from a high-energy molecule to their substrates ( i.e., phosphorylation ).Kinase-induced intracellular phosphorylation plays important roles in a variety of cellular processes including metabolism, cell signaling, protein regulation, DNA replication and repair.Consequently, kinases have become potential biomarkers for disease diagnosis and drug discovery, and the development of simple and sensitive methods for kinase assay is highly desirable.In this review, we summariZe the recent advances in kinase assays with protein kinase A (PKA), casein kinase-2( CKⅡ) and T4 polynucleotide kinase ( T4 PNK) as the models.We focus on the newly emerging methods for kinase assays including fluorescent, single-molecule detection, colorimetric, chemiluminescent, bioluminescent, and electrochemical and photoelectrochemical methods.Furthermore, we give a new insight into the future direction of kinase assays.%激酶是生物体内一类重要的磷酸转移酶,能够催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子(如ATP)向特定底物分子转移.激酶不但在新陈代谢、细胞信号传导、蛋白质调控、细胞传输等过程中起着关键作用,而且在临床诊断、药物研发及疾病靶向治疗等方面也发挥着重要作用.因此,发展灵敏度高、特异性好的激酶检测方法十分必要.本文以蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)、酪蛋白激酶(Casein kinase-2,CKⅡ)、T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)为例,对近年来发展的激酶检测方法进行了综述,着重介绍了荧光分析法、单分子检测、比色法、化学发光和生物发光分析法、电化学和光电化学分析法,并对激酶检测方法的发展方向进行了展望.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2018(046)001【总页数】9页(P11-19)【关键词】激酶;灵敏检测;分析方法;评述【作者】刘杨;邹笑然;李琛琛;张春阳【作者单位】山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014;山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014【正文语种】中文激酶(Kinase)是生物体内一类催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子(如ATP)向特定底物分子转移的酶，其催化的磷酸基团转移过程亦称磷酸化。
香烟烟雾提取物通过蛋白激酶 C-核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1表达
香烟烟雾提取物通过蛋白激酶 C-核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1表达江刚;张卫东【摘要】目的：探讨蛋白激酶C（PKC）-红系衍生的核因子相关因子2（Nrf2）对香烟烟雾提取物（CSE）诱导的大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1（HO-1）表达的影响。
方法：通过CSE刺激雄性SD大鼠气道上皮细胞，使用PKC抑制剂RO318220和Nrf2 siRNA，将细胞分为对照组、CSE 3 h组、RO318220组、Nrf2 siRNA组和RO318220＋Nrf2 siRNA组，用Western blotting法分别检测HO-1、Nrf2和p-PKC蛋白表达，免疫细胞化学法观察HO-1蛋白表达，逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）法检测HO-1 mRNA表达，免疫荧光法检测Nrf2蛋白定位，测定HO-1活性。
结果：暴露CSE 3 h后，Nrf2蛋白主要表达在胞核，胞核蛋白表达增强，p-PKC蛋白、HO-1的mRNA和蛋白高表达， HO-1活性增强。
预先给予RO318220，PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1的mRNA 和蛋白表达均明显减弱， HO-1活性显著降低。
预先用siRNA沉默Nrf2，胞浆和胞核的Nrf2蛋白表达均减弱，HO-1活性、mRNA和蛋白水平明显降低。
RO318220联合Nrf2 siRNA处理后，PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1 mRNA和蛋白表达均明显降低，HO-1活性明显降低。
结论：CSE通过PKC激活Nrf2，诱导Nrf2核转位，从而上调HO-1的表达水平。
%[ABSTRACT]AIM:Toobservetheeffectofthesignalingpathwayofprotein kinaseC(PKC)-nuclearfactor-ery-throid 2-related factor 2 (Nrf2) on the expression of heme oxygenase-1 (HO-1) induced by cigarette smoke extract (CSE) in the rat airway epithelial cells .METHODS:After exposed to CSE , the airway epithelial cells of male SD rats were di-vided into controlgroup , CSE3 group, RO318220 group, Nrf2 siRNA group andRO318220+Nrf2 siRNA group.The pro-tein levels of HO-1, Nrf2 and PKC were semi-quantified by Western blotting .The protein expression of HO-1 was assessed by immunocytochemistry .The mRNA expression of HO-1 was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) .Nrf2 protein location was observed by immunofluorescence staining .HO-1 activity was also determined .RE-SULTS:After exposure to CSE for 3 h, the Nrf2 protein was mainly located in the nucleus , and the expression level of Nrf2 protein in the nucleus was stronger than that in the control cells .CSE also significantly enhanced the levels of p-PKC protein, and HO-1 mRNA, protein and activity .Pretreatment withRO318220 significantly decreased the levels of PKC pro-tein, Nrf2 protein, and HO-1 mRNA, protein and activity.Meanwhile, Nrf2 protein significantly decreased , and the activ-ity, mRNA and protein levels of HO-1 were also significantly attenuated by pretreatment with siRNA to knock down Nrf2. Pretreatment with RO318220 and Nrf2 siRNA significantly decreased the PKC protein , Nrf2 protein, and HO-1 mRNA, protein andactivity .CONCLUSION:CSE up-regulates the HO-1 expression through PKC-induced nuclear translocation of Nrf2 in the rat airway epithelial cells .【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】6页(P1483-1488)【关键词】香烟烟雾提取物;蛋白激酶C;红系衍生的核因子相关因子2;血红素加氧酶1【作者】江刚;张卫东【作者单位】湖南省人民医院呼吸内科，湖南长沙410005;湖南省人民医院呼吸内科，湖南长沙410005【正文语种】中文【中图分类】R563.3氧化应激机制是引起慢性阻塞性肺疾病(chro-nic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要发病机制之一。
蛋白激酶c 氧化应激-概述说明以及解释
蛋白激酶c 氧化应激-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白激酶C (protein kinase C, PKC) 是一类具有酶活性的蛋白质，在细胞内发挥着重要的调控功能。
它参与多种信号转导途径，可以调节细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程。
氧化应激是指细胞内产生过多的活性氧物质，导致细胞内氧化还原平衡失调，从而引发一系列的细胞损伤和病理变化。
在氧化应激过程中，蛋白激酶C扮演着重要的角色。
本文旨在探讨蛋白激酶C在氧化应激中的作用机制以及与氧化应激相关疾病的关系。
首先，我们将介绍蛋白激酶C的定义与功能，包括它作为一种酶的特点和它所参与的信号转导通路。
接着，我们将详细阐述氧化应激的概念与机制，包括引起氧化应激的活性氧物质及其生成途径。
随后，我们将着重讨论蛋白激酶C在氧化应激中的作用机制，包括其在细胞内的定位与激活方式等。
此外，我们还将对蛋白激酶C与氧化应激相关疾病的研究进展进行综述。
近年来，许多研究表明，蛋白激酶C在氧化应激过程中的异常表达和功能异常与多种疾病的发生和发展密切相关。
例如，某些癌症、心血管疾病以及神经退行性疾病等都与蛋白激酶C的活性失调和氧化应激的增加有关。
最后，我们将总结蛋白激酶C在氧化应激中的作用和意义，并讨论当前研究存在的问题和展望。
通过对蛋白激酶C氧化应激的深入理解，我们有望为相关疾病的防治提供新的思路和策略。
综上所述，本文将全面探讨蛋白激酶C在氧化应激中的作用机制及其与相关疾病的关联，旨在深化对氧化应激生物学的认识，并为相关疾病的研究和治疗提供理论依据。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构这一部分主要介绍了整篇文章的组织结构和各个章节的内容概述，读者可以通过这一部分对整个文章的框架有一个清晰的认识。
2.正文部分分为四个章节，分别是蛋白激酶c的定义与功能、氧化应激的概念与机制、蛋白激酶c在氧化应激中的作用以及蛋白激酶c与氧化应激相关疾病的研究进展。
2.1 蛋白激酶c的定义与功能部分将介绍蛋白激酶c的基本定义和功能，包括其结构、酶活性以及在细胞信号转导中的作用。
热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。
PKCζ降低表达削弱了乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力
乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力1万五洲，张宁北京大学化学与分子工程学院化学生物学系，北京(100871)E-mail: nzhangchina@摘要：目的研究蛋白激酶 C ζ (PKCζ) 降低表达对乳腺癌细胞趋化运动和黏附能力的影响。
方法利用RNA干扰技术特异性降低PKCζ蛋白在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达，通过滤膜小室法 (Mircro-Boyden Chamber) 检测细胞的趋化运动能力，通过细胞黏附实验检测细胞的黏附能力。
结果 RNA干扰有效的降低了乳腺癌MDA-MB-231细胞中PKCζ蛋白的表达。
在表皮生长因子受体 (EGFR) 诱导下，与参照细胞相比，PKCζ降低表达后的细胞趋化运动能力和黏附能力都显著下降。
结论 PKCζ降低表达削弱了乳腺癌细胞的趋化运动能力和黏附能力。
关键词：蛋白激酶C ζ，表皮生长因子受体，乳腺癌，趋化运动，黏附中图分类号：R7371.引言PKCζ是蛋白激酶C (PKC) 家族的成员之一，属于非典型性PKC；与经典型PKC和新型PKC不同，PKCζ的激活不依赖于钙离子 (Ca2+) 或二酯酰甘油 (DAG)[1]。
研究表明，PKCζ在细胞的凋亡、极化及黏附过程中都发挥着重要作用：在人Caco-2细胞中，PKCζ可以抑制胶原蛋白依赖性及不依赖性的细胞增殖，促进细胞凋亡[2]；在星形胶质细胞的迁移过程中，PKCζ与Par6/Cdc42 形成了复合物，共同控制细胞的极化[3,4]；在嗜中性粒细胞的运动过程中，PKCζ可能还参与了Gi 蛋白所诱导的细胞黏附和肌动蛋白聚集过程[5]。
许多肿瘤细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌等的恶性转化都和细胞内 PKC 的表达水平升高或突变有关，但是对于PKC在癌细胞运动过程中的作用目前还研究较少[6]。
本文以乳腺癌MDA-MB-231细胞为模型，探讨了PKCζ降低表达对乳腺癌细胞趋化运动能力和黏附能力的影响。
2.材料和方法2.1 MDA-MB-231细胞的培养和传代人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞购自美国细胞菌种库 (American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA)，来源是人乳腺器官，属于上皮细胞腺癌。
蛋白激酶A与蛋白激酶C的研究进展
蛋白激酶A与蛋白激酶C的研究进展Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】蛋白激酶A与蛋白激酶C的研究进展摘要：蛋白激酶A（PKA）与蛋白激酶C（PKC）是参与细胞信号转导的两类物质。
PKA全酶是四聚体，由两个调节亚基R和两个催化亚基C组成，PKC均为单链多肽，分为3类。
PKA参与的信号通路以cAMP为第二信使，而PKC参与的信号通路却以DAG和IP3为信使。
这两个信号通路都是由G蛋白耦联受体所介导的，都能调控基因的转录，而在这个过程中，PKA进入细胞核，PKC则与质膜结合。
关键字：蛋白激酶A（PKA）蛋白激酶C（PKC）第二信使磷酸化1前言蛋白激酶是一类在胞内信使依赖的、在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作用并帮助完成信号传递过程的酶。
蛋白激酶负责将磷酸基团转移到特定底物蛋白上，这类酶用 ATP 或GTP作为磷酸基团的供体，而蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸作为磷酸基团的受体。
目前己发现在真核细胞内有400多种蛋白激酶，它们催化多种功能蛋白，如酶、受体、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白等。
功能蛋白通过磷酸化和去磷酸化，发生构象互变，导致功能蛋白的活性、性质的改变，从而调节细胞各个生命活动过程。
本文简要介绍蛋白激酶大家族中其中的两类：蛋白激酶A与蛋白激酶C。
蛋白激酶A(PKA)又叫cAMP依赖性蛋白激酶，是Kerbs等人在继sutherland 等人提出cAMP第二信使的概念之后，在研究糖原的代谢过程中发现的．是普遍存在于动物体内的一种蛋白激酶。
近年来，cAMP作为第二信使的研究较多，有学者已经从分子水平上研究cAMP与人类疾病的关系，如细胞的异常生长和增殖等。
蛋白激酶A特别是蛋白激酶A Iα(PKA Iα)作为cAMP的主要调节分子，在癌细胞系、原发性肿瘤和增生过度的细胞中呈过度表达。
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是细胞信号转导途径中的重要递质。
激酶活性测试实验报告
一、实验目的本实验旨在通过磷酸肌酸底物法测定肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）的活性，并探讨其在生物体内的功能。
通过实验，了解CK活性受温度、pH值等因素的影响，以及酶的激活和抑制现象。
二、实验原理肌酸激酶（CK）是一种广泛存在于生物体内的重要酶，参与细胞内能量代谢过程。
磷酸肌酸底物法是一种常用的测定CK活性的方法。
该法基于CK催化磷酸肌酸（Creatine Phosphate，CP）与ADP反应生成ATP和肌酸（Creatine，Cr）的原理。
在特定条件下，ATP的生成量与CK的活性成正比。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 肌酸激酶样品- 磷酸肌酸（CP）- ADP- NADH- 磷酸氢二钠（NaH2PO4）- 磷酸二氢钠（Na2HPO4）- 氯化镁（MgCl2）- 氯化钠（NaCl）- 碘化钾（KI）- 碘液- 水浴锅- 移液器- 试管- 离心机2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 量筒- 胶头滴管- 恒温箱四、实验方法与步骤1. 配制底物溶液：- 称取一定量的CP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。
- 称取一定量的ADP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。
- 将NADH用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。
2. 配制反应混合液：- 取若干试管，分别加入不同浓度的肌酸激酶样品、磷酸肌酸溶液、ADP溶液、NADH溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、氯化镁溶液和氯化钠溶液。
- 将混合液置于水浴锅中，调节温度至实验设定的温度。
3. 测定酶活性：- 在特定时间点，向反应混合液中加入碘液，观察溶液颜色的变化。
- 用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度值。
- 根据吸光度值计算酶活性。
4. 稳定酶活性：- 在实验过程中，分别调节pH值和温度，观察酶活性的变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性与温度的关系：- 实验结果表明，随着温度的升高，CK的活性逐渐增加，但当温度超过一定范围时，酶活性开始下降。
PKC的酶学特征及在结肠癌中的研究进展
・
１２６７・
・综述・讲座・ ＰＫＣ的酶学特征及在结肠癌中的研究进展
范桂莲 王玉国 何 苗
ＰＫＣ的酶学特征 ＰＫＣ的超家族成员 根据不同亚单位在结构和功能上
蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的家族成
１ １．１
员，对细胞的生长、分化：凋亡等信号转导均起重要作用。因而
Ｊ０１ａｎｄａ Ｈ．ＬｉｏｎｅＩ Ｇ，Ｅｒｉｋ
ｔｉｏｎ Ｂ，ｅｔ ａＩ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＰＫＣ与结肠癌细胞的分化
Ｒｉｃｋａｒｄｌ等Ｈ１在人类结肠
上皮细胞的体外研究还发现ＰＫＣ的激活可以增加丁酸盐诱
导的细胞分化和更新。丁酸盐是一个潜在的分化因素，在结 肠癌细胞中，它能促进许多细胞分化标记物的表达，包括碱性
ｃ ａｃｔｉｖａ—
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｃｅＩｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｔｅｎｉｎ—ｎｅｇｅｔｉｖｅ
ｃｏｌｏｎ
ｃａｎｃｅｒ
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Байду номын сангаасｃｅｌｌ
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１１６
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［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９７，１３７（５）１１ １０３—１
ＰＫＣ的结构及调节
对ＰＫｃ各亚单位分子的结构分
析表明，ＰＫＣ分子中有４个相对保守的区域，从氨基端到羧
基端分别命名为Ｃ１一Ｃ４结构域。Ｃ１是ＤＡＧ的结合位点，
Ｃ２是ｃａ”的结合位点，Ｃ１和Ｃ２合称ＰＫｃ的调节区。Ｃ３有 一个ＡＴＰ结合基序，为ＰＫＣ提供能量和磷酸基团，ｃ４是底 物结合区，Ｃ３和Ｃ４合称为ＰＫＣ的催化区。
收稿日期２０１０一０２～２２
乳腺癌中PKCζ、MMP-2、MMP-9的表达及相关性
乳腺癌中PKCζ、MMP-2、MMP-9的表达及相关性杨硕;李洪利;李文通;杨璐;倪明;翟丽敏;尹崇高;张宝刚【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2014(000)009【摘要】目的：探讨乳腺癌中蛋白激酶C灼(protein kinase C灼, PKC灼)、基质金属蛋白酶-2( matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的表达及三者与其侵袭、转移的关系。
方法应用免疫组化PV 9000两步法检测PKC灼、MMP-2、MMP-9在100例乳腺癌组织及对应癌旁正常乳腺组织中的表达,并分析三者表达的相关性。
应用RNAi 技术将合成的PKC灼-siRNA转染入乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,即siPKC灼/MDA-MB-231细胞组,以转染空载质粒的scr/MDA-MB-231的细胞组作为对照组,应用Transwell侵袭实验检测细胞的体外侵袭能力。
利用Western blot法检测转染细胞中PKC灼蛋白的表达。
酶联免疫吸附实验( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养基中MMP-2、MMP-9的含量。
结果PKC灼、MMP-2、MMP-9在乳腺浸润性导管癌中的阳性率分别为62.5%、37.5%、32.5%,明显高于乳腺导管内癌和癌旁正常乳腺组织(P均<0.05)。
PKC灼蛋白表达与淋巴结转移、远处转移有关(P均<0.01),与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、ER、PR等无关( P均>0.05)；转染 siRNA的 siPKC灼/MDA-MB-231细胞组与 scr/MDA-MB-231组相比,体外侵袭能力以及PKC灼蛋白的表达水平明显下降(P均<0.05),培养基中MMP-2、MMP-9蛋白表达量亦明显下降(P均<0.05)。
激酶活性报告模板
激酶活性报告模板1. 引言本报告旨在描述激酶活性的实验结果和分析。
激酶活性是生物化学和药物研究中一个重要的指标，用于评估化合物对酶的影响。
在本实验中，我们使用了一种标准的酶抑制实验来测定激酶的活性。
本报告将详细介绍实验的设计、方法和结果，并进行相应的数据分析和讨论。
2. 实验设计2.1 实验目的本实验的目的是评估化合物对激酶的抑制活性。
我们选择了特定的激酶作为目标，并采用了一种已经验证过的酶抑制实验方法。
2.2 材料和仪器在本实验中，我们使用了以下材料和仪器：•激酶底物•收集样品并储存在适当的条件下的冷冻设备•酶抑制剂•显微镜和显微镜幻灯片•净化设备和试剂•高压液相色谱仪2.3 实验流程本实验的流程如下：1.准备酶底物溶液并将其酶解。
2.添加适当浓度的激酶和酶抑制剂，并使其反应。
3.根据反应时间收集样品。
4.通过离心等方式净化样品。
5.采用高压液相色谱仪分析样品。
6.记录实验数据并进行数据分析。
3. 实验方法3.1 酶底物酶解首先，我们准备了酶底物溶液并将其酶解。
酶底物溶液的配制方法如下：1.取适量的酶底物，并按照厂家提供的说明书中的方法进行配制。
2.确保酶底物溶液的浓度在实验需要的范围内。
3.将酶底物溶液加入适量的酶解缓冲液中，并根据实验需求进行酶解反应。
3.2 激酶活性测定在酶底物酶解完毕后，我们进行了激酶活性测定实验。
实验过程如下：1.取适量的酶底物酶解产物，并将其与适量的激酶和酶抑制剂混合。
2.根据实验要求，确定反应时间，并在相应时间点收集样品。
3.收集样品后，采用离心等方法净化样品，以去除杂质。
4.净化后的样品通过高压液相色谱仪进行分析，并记录各时间点的峰值面积。
3.3 数据处理和分析最后，我们对实验数据进行了处理和分析，以评估抑制剂对激酶活性的影响。
数据处理和分析的方法如下：1.将每个时间点的峰值面积进行统计，并得到各时间点的相对活性值。
2.绘制相对活性值与时间的曲线，以观察激酶活性的变化趋势。
蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移分析
蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移分析李俊青;江建明;冯瑞强;蒋晖;闫文娟;杨德鸿【摘要】Objective To investigate the changes in the expressions of Fas-associated death domain protein (FADD) and cellular-FLICE inhibitory protein (c-FLIP) in the articular cartilage of patients with Kashin-Beck disease (KBD) and the role of these proteins in the pathogenesis of KBD. Methods The cartilage samples were collected from patients with established diagnosis of KBD and osteoarthritis and from healthy control subjects undergoing amputation due to traffic accidents. The expressions of Fas-associated death domain protein (FADD) and cellular-FLICE inhibitory protein (c-FLIP) in the cartilage were detected by immunohistochemistry, and the positive chondrocytes were counted in different layers of the articular cartilage under microscope. Results The positivity rates of FADD in the middle layer of articular cartilage from patients with KBD [(28.68±2.19)%] and osteoarthritis [(35.40±2.34)%] were significantly higher than that in normal cartilage [(10.51 ±5.02)%, F=16.245, P=0.000], but the rates in the upper and deeper layers were comparable among the 3 groups (P=0.206-0.761). In KBD cartilage, FADD expression was the highest in the middle layer [(28.68±5.38)%] followed by the deeper layer [(17.94±8.38)%]. Compared with the healthy controls, KBD and osteoarthritis patients showed significantly higher FLIP expression in the upper layer of the cartilage (F=5.929, P=0.018) but similar expressions in middle and deeper layers. Conclusions KBD patients have significantincreased FADD expression in the middle layer but decreased FLIP expression in the upper layer of the cartilage, suggesting that the death receptor pathway and its regulators play important roles in the pathogenesis of KBD.%目的当前,检测蛋白激酶C(PKC)激活的方法尚缺乏灵敏性或直接性,这里我们提供了一种新的直接而灵敏的方法——利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术来构建检测PKC激活的方法.方法将表达PKC激活的报告分子(CKAR)的质粒单独转染或与表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒共转染HEK293细胞,培养72 h后用激光共聚焦显微镜检测FRET的变化,并以此判断甲状旁腺素或佛波酯是否激活PKC.结果在只转染CKAR质粒的HEK293细胞,佛波酯降低了CKAR分子的FRET效率,并使青色荧光与黄色荧光的比值(C/Y)增加,而PTH( 1-34)未能改变C/Y的值.在共转染了CKAR 和PTHR1质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)则使C/Y增加.结论 PKC激活报告分子可用于检测PKC的激活,该方法也可作为PKC相关信号转导的实验平台.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2011(031)011【总页数】4页(P1867-1870)【关键词】蛋白激酶C;荧光共振能量转移;PKC激活报告分子【作者】李俊青;江建明;冯瑞强;蒋晖;闫文娟;杨德鸿【作者单位】南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院口腔科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515【正文语种】中文【中图分类】R34蛋白激酶C（PKC）是一个重要的涉及细胞功能的信号分子，参与体内多个生理和病理过程［1-4］。
细胞角蛋白8在促肾上腺皮质激素释放因子诱导的肠上皮通透性改变中的作用
细胞角蛋白8在促肾上腺皮质激素释放因子诱导的肠上皮通透性改变中的作用胡玥;陈超英;张梦;吕宾【摘要】目的:探讨细胞角蛋白8(CK8)在促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)诱导的肠上皮细胞间通透性改变中的作用及机制.方法:培养人结肠腺癌HT29细胞株建立肠上皮屏障模型,采用免疫荧光法检测HT29细胞表面CRF受体1(CRFR1)及CRFR2的表达情况,并将其分为对照组和CRF组,CRF组以100 nmol/L CRF处理细胞72 h.采用Transwell小室检测2组细胞FITC标记的dextran透过率,透射电镜观察2组细胞紧密连接结构变化,并用Western blot法检测2组细胞CK8及紧密连接相关蛋白(ZO-1和occludin)的表达,免疫荧光检测CK8表达微结构变化,ELISA检测加药5 min、10 min、30 min、1 h及2 h后蛋白激酶C(PKC)活性.采用sh-CK8慢病毒构建CK8低表达HT29细胞,检测给予CRF处理后相应蛋白表达量、FITC标记的dextran透过率及PKC活性的改变.结果:HT29细胞表面存在CRFR1及CRFR2受体,而CRF处理后,FITC标记的dextran透过率高于对照组(P<0.05),透射电镜观察可见对照组细胞紧密连接通道关闭,CRF处理后紧密连接开放.同时,CRF可引起HT29细胞CK8的荧光强度增高,呈颗粒样浓聚,其蛋白表达明显增加(P<0.05),而occludin和ZO-1表达下调(P<0.05).此外,CRF处理1 h时,PKC的活性下降(P<0.05).sh-CK8慢病毒转染HT29细胞后成功建立低表达CK8细胞株,与阴性对照组相比,CRF刺激后肠上皮细胞通透性并未明显降低,occludin蛋白表达仍下调(P<0.05),而ZO-1则无明显改变.同时,与阴性对照组相比,CK8低表达后,CRF刺激并未引起PKC活性的下降.结论:CK8可能通过抑制PKC活性参与CRF诱导的肠上皮通透性的增加,同时可能存在其它信号通路共同参与.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2019(035)005【总页数】7页(P900-906)【关键词】肠易激综合征;细胞角蛋白8;促肾上腺皮质激素释放因子;紧密连接;蛋白激酶C【作者】胡玥;陈超英;张梦;吕宾【作者单位】浙江中医药大学附属第一医院消化科, 浙江杭州 310006;浙江中医药大学附属第一医院消化科, 浙江杭州 310006;浙江中医药大学附属第一医院消化科, 浙江杭州 310006;浙江中医药大学附属第一医院消化科, 浙江杭州 310006【正文语种】中文【中图分类】R574.4;R363.2肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)作为一种临床常见的胃肠功能紊乱性疾病[1]，其发病机制尚未完全明确，目前研究指出腹泻型IBS患者存在小肠和结肠肠黏膜屏障的损伤[2-4]。
G蛋白-PLC-PKC信号通路的调节
G蛋白
（超级家族）
小G蛋白
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3
PLC简介
磷脂酶C (Phospholipase C， PLC)是以G蛋白为传导物 的磷脂酰肌醇信号通路的关键酶，在机体内分布极为广泛。
磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸 (PIP2)
活化的PLC
二酯酰甘油 (DAG)
三磷酸肌醇 (IP3)
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5
PKC简介
蛋白激酶 C（PKC）为丝氨酸/苏氨酸激酶家族， 一种Ca2+激活的磷脂依赖性蛋白激酶，广泛分布 于机体各器官，参与不同细胞功能调节，如调节 基因的表达、细胞增殖、细胞凋亡、细胞的迁移 等 有研究表明，PKC可能参与了肿瘤细胞MDR的形 成过程，且不同的亚型在不同的MDR细胞中的表 达及功能具有差异性
激活
蛋白激酶 C（PKC）
Ca2+
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4
PLC对信号通路的调控
据研究表明，PLC 对PIP2 的水解需要一定浓度的Ca2+， Ca2+ 也可能是PLC 上游调控因素之一；Ca2+ 对IP3 有负 调控作用，这种作用在水稻糊粉层细胞中也得到证明 大量的研究表明，PLCε参与肿瘤的发生发展，干扰 PLCε 的表达能够抑制整合素的活性，致癌细胞的粘附减少； PLCε具有调节 PKC 活性的潜能
plc具有调节pkc活性的潜能page蛋白激酶cpkc为丝氨酸苏氨酸激酶家族一种ca激活的磷脂依赖性蛋白激酶广泛分布于机体各器官参与不同细胞功能调节如调节基因的表达细胞增殖细胞凋亡细胞的迁移有研究表明pkc可能参与了肿瘤细胞mdr的形成过程且不同的亚型在不同的mdr细胞中的表达及功能具有差异性page大量研究证实上调pkc的活性能够增加癌细胞的动力侵袭能力抑制pkc的活性能够很好的逆转此恶性生物学行为实验研究充分证明了pkc在nm23hl抑制肿瘤转移的过程中収挥了重要的作用以及nm23hi基因可能通过调控第二信使ca的浓度变化从而影一响pkc的激活转位由此调节pkc的活性变化来収挥其肿瘤转移抑制作用pagepkc对该信号通路的调节pkc激活剂pma可通过依赖pkc方式诱导tbx3转录因子tbox族成员之一的表达
蛋白激酶检测方法
1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′- TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAAG2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
实验报告细胞信号传导与蛋白激酶实验
实验报告细胞信号传导与蛋白激酶实验实验报告细胞信号传导与蛋白激酶实验一、引言细胞信号传导是细胞内外信息交流的重要过程，调节各种生物学功能的执行。
蛋白激酶作为信号传导路径中的关键组分，扮演着重要的角色。
本实验旨在探究细胞信号传导和蛋白激酶的作用机制及其相互关系。
二、材料与方法1. 材料：- 细胞培养物- 不同细胞系的培养基- 蛋白激酶抑制剂- 细胞信号传导激活剂2. 方法：1）细胞培养和处理2）蛋白激酶抑制剂处理3）细胞信号传导激活剂处理4）细胞采集和蛋白质提取5）Western blot检测蛋白激酶活性6）数据分析和统计三、结果与讨论1. 细胞信号传导激活剂的作用经处理细胞系A和细胞系B，观察到细胞信号传导激活剂对两者均产生明显的影响。
在细胞系A中，细胞信号传导激活剂能够促使蛋白激酶A的激活，进而引发下游信号级联反应。
而在细胞系B中，细胞信号传导激活剂的作用则主要影响蛋白激酶B的活性。
2. 蛋白激酶抑制剂的作用加入蛋白激酶抑制剂后，细胞系A和细胞系B均观察到蛋白激酶活性的下降。
这表明蛋白激酶抑制剂对于细胞信号传导途径中蛋白激酶的活性产生了明显的抑制作用。
3. Western blot结果分析通过Western blot检测，对细胞系A和细胞系B的蛋白样本进行分析，观察蛋白激酶A和蛋白激酶B的表达和活性。
结果显示，在正常条件下，这两种蛋白激酶在两个细胞系中均有一定的基础表达水平。
而在添加信号传导激活剂后，表达水平和活性均有显著提高。
但当加入蛋白激酶抑制剂时，表达水平和活性则明显下降。
四、结论通过本实验，我们发现细胞信号传导与蛋白激酶之间存在密切的关联。
细胞信号传导激活剂可以促使特定的蛋白激酶的活性增加，从而引发相关的细胞功能反应。
而蛋白激酶抑制剂则可以抑制蛋白激酶的活性，并导致信号转导通路的受阻。
通过本实验的结果，我们对细胞信号传导和蛋白激酶的作用机制有了更深入的认识。
值得注意的是，本实验只是针对特定的细胞系和蛋白激酶进行了研究。
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激酶检测：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）
基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC
活化度）。
操作步骤：
1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到
2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×BufferPepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer，5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)，5ul
PKC Activator 5X Solution 超声处理的，5ul
短肽保护液（非必须），1ul
样品， 9ul
去离子水使终体积为，25ul
PKC阳性对照检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer，5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) ，5ul
PKC Activator 5XSolution 超声处理的，5ul
短肽保护液（非必须），1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer），4ul
去离子水使终体积为，25ul
PKC阴性对照检测（不加PKC）
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer，5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) ，5ul
PKC Activator 5XSolution 超声处理的，5ul
短肽保护液（非必须），1ul
去离子水使终体积为，25ul
7．在0 时间点，把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2 分钟。
然后加入样品或蛋白激酶C 在30℃再孵育30 分钟。
8．把管子放进开水浴或95℃加热块10 分钟以终止反应。
在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃或-20℃。
9．把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul 的80％甘油，以确保样品保留在上样孔中（说明书第III.F 部分）。
10．每孔点样10ul，在0.8% 琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。
检测结果：
说明：后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。
注：阳性条带以Gel pro4 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。
按照百分比例计算PKC活性百分比
（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）
Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Lane 6Lane PC
Rows( % )( % )( % )( % )( % )( % )( % ) PKC77.08275.61688.9866.97577.9374.645100 p-PKC22.91824.38411.0233.02522.0725.3550
Sum100100100100100100100 p-
0.297320.3224710.1238480.4930940.2832030.3396740 PKC:PKC
样本#1#2#3#4#5#6PC。