第七节代谢控制育种
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在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合 碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不 利影响。
根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变 株。
.
（一）解除碳源调节突变株的选育
筛选方法： 1、循环培养法
葡萄糖
乳糖
O-硝基苯
酚-β-D-半
突变株 野生株
乳糖苷
2、鉴别培养基 有半乳糖酶
喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野
解除碳、氮、磷源分解调节突变株
营养缺陷突变株 渗漏缺陷突变株 回复突变株 耐自身代谢产物突变株 抗终产物结构类似物 耐前体物突变株 条件突变株
营养缺陷突变株 生物素、油酸、甘油缺陷型 温敏突变株
.
一、组成型突变株的选育
组成型突变株是指操纵基因或调节基因 突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱 导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突 变型。
野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导 酶，不能利用乳糖而. 淘汰。
2、循环培养法
诱变
含诱导物
含诱导物
不含诱
不含诱
导物
百度文库
导物
.
3、鉴别性培养基的应用
向菌落上喷射
涂布
O-硝基苯酚β-D-半乳糖苷
组成型 突变株
诱导型
诱变后的 以甘油为唯一碳源
孢子 原理 ： 组成型菌株在没有诱导物的作用下
仍能合成 β－半乳糖苷酶，将无色试剂水解 ， 放出 O－硝基苯酚。 .
.
3.限制抗生素合成的诱导物 甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物
色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸 合成酶等的抑制剂；
4.抑制或阻遏磷酸酯酶类的合成 链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些
中间代谢产物需经磷酸化，因此从中间产物到终 产物需由磷酸酯酶类， 而磷酸盐抑制或阻遏磷 酸酯酶的合成。
例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑 制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。
生 型是白色。
3、特殊氮源
组氨酸酶突变株
葡萄糖+组氨酸
分解代谢抑制物+唯一必须被分解的氮源
.
4、葡萄糖结构类似物
CHO H OH HO H H OH H OH
CHO HH HO H H OH H OH
CHO H OHO H3C-O H H OH H OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
葡萄糖 2-脱氧－葡萄糖 3－O－甲基－ 葡萄糖
.
特 性： 1、结构与葡萄糖类似。 2、不被微生物代谢， 也不阻抑微生 物生长。 3、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的 合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还 要强。
.
筛选方法：
诱变 后的 菌株
培养基含有氮源、无机盐、生
长因子、低浓度的2－dG或3－
mG及一种生长碳源 ，该碳源
需诱导酶才能利用
涂布
验证
选育有关抗分解调节的突变株，其实就是 筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏 或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长 期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。
.
（一）解除碳源调节突变株的选育
在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转 酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等 抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。
这两种突变株在工业上都可能得到应用， 特别是在微生物酶制剂工业上。
Regulatory gene
repressor NO operator
operator
NO repressor
.
筛选方法
1、限量诱导物法
诱变 恒化器
低乳糖浓 度
突变株不需诱导物也能合成 β- 半乳糖 苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为 能源和代谢原料，而迅速生长。
. 水解蛋白10mg/ml
（三）磷酸盐对次级代谢的调节 机制
1.通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起
始。 磷酸盐是许多初级代谢反应酶的 效应物。 2.改变糖类分解代谢途径：
磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊 糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导 的抗生素合成受抑制。 例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃 霉素
含葡萄糖
.
不含 葡萄糖
含淀粉
（二）解除氮源分解调节突变株的 选育
次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他 快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调 节作用。
筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶 产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑 制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。
氨基酸1.5mg/ml
4、筛选
将处理后的菌体移接到含有诱导能力 低，但能作为良好碳源的诱导物的培养 基中培养，突变体能良好生长，野生型 不能生长。 例：β-半乳糖苷酶组成突变株的筛选
底物采用苯- β-半乳糖
.
二、抗分解调节突变株的选育
抗分解调节突变株：指抗分解阻遏和分解抑 制的突变 （一）解除碳源调节突变株的选育 （二）解除氮源分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐调节突变株的选育
第四节 代谢调节控制育种
代谢调节控制育种是通过特定突变型的选 育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产 物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜 的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。
外因控制 内因控制
培养调节 突变体
.
调节体系
诱导 分解阻遏 分解抑制 反馈阻遏 反馈抑制
细胞膜渗透性
育种措施
1组成型突变株的选育 2抗分解调节突变株的选育
比不 较含
含阻遏物
阻
遏
物
.
例如： 桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉 、 酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂平板。
木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素 、蛋白 胨、无机盐、胆汁 、防菌扩展剂、2-dG的琼 脂平板。
.
抗性突变株的性质
在2-dG或3-mG平板上生长的菌落接入斜面， 对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产 酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解 阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养 基中酶活力往往高于野生型菌株。
脱敏感 突变
不含Na3PO4
底部加浸润250mm/L 磷酸盐的滤纸
敏感. 菌
三、营养缺陷型在代谢调节育种中 的应用
生物遗传学上：阐述代谢途径 工业微生物代谢控制育种上：筛选
到解除反馈的菌株。
.
（一）在初级代谢调节育种的应用
.
磷酸盐对ATP调节：cAMP ATP 例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐
对杀假丝菌素合成的影响。当加入 10mol//L磷酸盐后，5minATP增加5倍， 15min抗生素合成受抑制。 发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。
.
解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育
灰色链霉菌
诱变后涂布于琼脂平 板
含10mol/LNa3PO4
根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变 株。
.
（一）解除碳源调节突变株的选育
筛选方法： 1、循环培养法
葡萄糖
乳糖
O-硝基苯
酚-β-D-半
突变株 野生株
乳糖苷
2、鉴别培养基 有半乳糖酶
喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野
解除碳、氮、磷源分解调节突变株
营养缺陷突变株 渗漏缺陷突变株 回复突变株 耐自身代谢产物突变株 抗终产物结构类似物 耐前体物突变株 条件突变株
营养缺陷突变株 生物素、油酸、甘油缺陷型 温敏突变株
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一、组成型突变株的选育
组成型突变株是指操纵基因或调节基因 突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱 导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突 变型。
野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导 酶，不能利用乳糖而. 淘汰。
2、循环培养法
诱变
含诱导物
含诱导物
不含诱
不含诱
导物
百度文库
导物
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3、鉴别性培养基的应用
向菌落上喷射
涂布
O-硝基苯酚β-D-半乳糖苷
组成型 突变株
诱导型
诱变后的 以甘油为唯一碳源
孢子 原理 ： 组成型菌株在没有诱导物的作用下
仍能合成 β－半乳糖苷酶，将无色试剂水解 ， 放出 O－硝基苯酚。 .
.
3.限制抗生素合成的诱导物 甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物
色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸 合成酶等的抑制剂；
4.抑制或阻遏磷酸酯酶类的合成 链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些
中间代谢产物需经磷酸化，因此从中间产物到终 产物需由磷酸酯酶类， 而磷酸盐抑制或阻遏磷 酸酯酶的合成。
例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑 制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。
生 型是白色。
3、特殊氮源
组氨酸酶突变株
葡萄糖+组氨酸
分解代谢抑制物+唯一必须被分解的氮源
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4、葡萄糖结构类似物
CHO H OH HO H H OH H OH
CHO HH HO H H OH H OH
CHO H OHO H3C-O H H OH H OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
葡萄糖 2-脱氧－葡萄糖 3－O－甲基－ 葡萄糖
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特 性： 1、结构与葡萄糖类似。 2、不被微生物代谢， 也不阻抑微生 物生长。 3、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的 合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还 要强。
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筛选方法：
诱变 后的 菌株
培养基含有氮源、无机盐、生
长因子、低浓度的2－dG或3－
mG及一种生长碳源 ，该碳源
需诱导酶才能利用
涂布
验证
选育有关抗分解调节的突变株，其实就是 筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏 或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长 期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。
.
（一）解除碳源调节突变株的选育
在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转 酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等 抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。
这两种突变株在工业上都可能得到应用， 特别是在微生物酶制剂工业上。
Regulatory gene
repressor NO operator
operator
NO repressor
.
筛选方法
1、限量诱导物法
诱变 恒化器
低乳糖浓 度
突变株不需诱导物也能合成 β- 半乳糖 苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为 能源和代谢原料，而迅速生长。
. 水解蛋白10mg/ml
（三）磷酸盐对次级代谢的调节 机制
1.通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起
始。 磷酸盐是许多初级代谢反应酶的 效应物。 2.改变糖类分解代谢途径：
磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊 糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导 的抗生素合成受抑制。 例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃 霉素
含葡萄糖
.
不含 葡萄糖
含淀粉
（二）解除氮源分解调节突变株的 选育
次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他 快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调 节作用。
筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶 产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑 制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。
氨基酸1.5mg/ml
4、筛选
将处理后的菌体移接到含有诱导能力 低，但能作为良好碳源的诱导物的培养 基中培养，突变体能良好生长，野生型 不能生长。 例：β-半乳糖苷酶组成突变株的筛选
底物采用苯- β-半乳糖
.
二、抗分解调节突变株的选育
抗分解调节突变株：指抗分解阻遏和分解抑 制的突变 （一）解除碳源调节突变株的选育 （二）解除氮源分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐调节突变株的选育
第四节 代谢调节控制育种
代谢调节控制育种是通过特定突变型的选 育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产 物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜 的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。
外因控制 内因控制
培养调节 突变体
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调节体系
诱导 分解阻遏 分解抑制 反馈阻遏 反馈抑制
细胞膜渗透性
育种措施
1组成型突变株的选育 2抗分解调节突变株的选育
比不 较含
含阻遏物
阻
遏
物
.
例如： 桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉 、 酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂平板。
木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素 、蛋白 胨、无机盐、胆汁 、防菌扩展剂、2-dG的琼 脂平板。
.
抗性突变株的性质
在2-dG或3-mG平板上生长的菌落接入斜面， 对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产 酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解 阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养 基中酶活力往往高于野生型菌株。
脱敏感 突变
不含Na3PO4
底部加浸润250mm/L 磷酸盐的滤纸
敏感. 菌
三、营养缺陷型在代谢调节育种中 的应用
生物遗传学上：阐述代谢途径 工业微生物代谢控制育种上：筛选
到解除反馈的菌株。
.
（一）在初级代谢调节育种的应用
.
磷酸盐对ATP调节：cAMP ATP 例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐
对杀假丝菌素合成的影响。当加入 10mol//L磷酸盐后，5minATP增加5倍， 15min抗生素合成受抑制。 发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。
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解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育
灰色链霉菌
诱变后涂布于琼脂平 板
含10mol/LNa3PO4