组氨酸发酵条件及高产菌株选育研究进展
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China Brewing
L-组氨酸（L-Histidine ）化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸[1]。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业。尤其在医药领域的作用日益受到重视，目前，其主要应用于氨基酸输液及综合氨基酸制剂方面，已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年递增。但目前L-组氨酸生产的先进技术主要掌握在欧、美、日等发达国家手里，主要采用发酵法。日本在20世纪70年代就开展发酵生产组氨酸的研究，而国内在这方面还仅处于实验室研究阶段[2-3]。因此加快研究发酵法生产L-组氨酸具有非常重要的意义。1发酵法生产L-组氨酸
发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对组氨酸产生菌进行诱变，选育出营养缺陷型及组氨酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累L-组氨酸的目的[4-5]。其具有原料成本低，反应条件温和极易实现大规模生产等优点，是一种非常经济有效的生产方法[6]。1.1L-组氨酸的产生菌
目前发现的组氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌和粘质赛氏杆菌。已投入工业化生产的有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和粘质塞氏杆菌，其产酸水平分别为15.4g/L 、12.5g/L 和17.0g/L ，糖酸转化率分别为15.4%、12.5%、10.0%[7]。1.2发酵过程中pH 值的控制
大部分组氨酸发酵培养基中的氮源是硫酸铵，当铵离子被利用之后，剩余的硫酸根离子会导致发酵液的pH 值下降，从而对发酵产生影响。可以考虑在发酵培养基中添加碳酸钙，因为碳酸钙可以中和硫酸根离子，通过优化试验确定碳酸钙的最佳添加量。1.3生物素对L-组氨酸发酵的影响
作为L-组氨酸的主要产生菌，谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型菌，生物素是细胞生长的必需因子，同时还是多种羧化酶的辅酶，在CO 2固定反应中起重要作用，可影响糖酵解速度，改变发酵代谢流向。添加适量的生物素可以增加单磷酸己糖支路（HMP ）途径的代谢流量，有利于L-组氨酸的产生[8]。
1.4柠檬酸钠对L-组氨酸发酵的影响
在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A 的代谢流分布，保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP 之间代谢流量平衡[9-11]。在发酵培养基中添加适量的柠檬酸钠后葡萄糖的酵解途径EMP 被抑制，使碳架流向HMP 途径，有利于组氨酸的生成[12]。
影响组氨酸发酵的因素还有许多，可以通过正交试验或响应面法进行优化试验。2L-组氨酸的测定方法
对L-组氨酸含量测定的研究较少，建立一种简便可行的测定方法，对组氨酸的生产具有指导意义。目前较常用
组氨酸发酵条件及高产菌株选育研究进展
孙希叶，杨平平，李
旋，王燕*
（山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353）
摘要：L-组氨酸是含咪唑核的碱性氨基酸，是人体和动物体内的半必需氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，应用广泛，尤其在医
药领域中的应用日益受到重视，是市场上急需的氨基酸品种之一。文中简要介绍了发酵法生产L-组氨酸及产物检测方法，通过对L-组氨酸生物合成途径的分析指出了大量合成L-组氨酸的关键控制点及选育的基本思路，并重点概括了国内外对L-组氨酸高产菌株选育方案的研究。关键词：L-组氨酸；发酵；代谢途径；选育方法中图分类号：TQ922
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）09-0028-03
Study Progress of fermentation conditions of L-histidine and screening of high productive strain
SUN Xiye,YANG Pingping,LI Xuan,WANG Yan*
(College of Food and Biological Engineering,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China)
Abstract:L-histidine is an alkalescency amino acid with an imidazole core.It's a semi-essential amino acid in human and animals.L-histidine has a variety of physiological functions,and has been widely used,especially in the field of medicine.It is one of the urgently needed amino acid on the market.Production of L-histidine by fermentation and concerned detecting methods was briefly introduced.Critical control points of high-level synthesis of L-histidine and the basic idea for screening of strains were summarized after analysis of biosynthetic pathways L-histidine,and approaches to screening of strains were emphasized,as well.
Key words:L-histidine;fermentation;metabolic pathway;screening approaches
收稿日期：2009-11-22
作者简介：孙希叶（1986-）女，山东临沂人，在读硕士研究生，研究方向为微生物资源开发；王燕*，教授，通讯作者。
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2010年第9期总第222期的有比色法和高效液相色谱法。
比色法是测定组氨酸含量的简便方法，Pauly 比色法简单、快速，准确性也比较好，对仪器的要求也不高，比较适用于工业生产中组氨酸的快速测定[13]。但试验证明此法受铵离子的影响较大，铵离子与Pauly 试剂反应呈黄色，会将组氨酸的橙红色覆盖掉。另外茚三酮显色-分光光度法也是一种常用的比色法，该法易于实现、精密度较好，适合在菌种选育过程中定性、定量测定发酵液中的L-组氨酸[14]。
高效液相色谱法是一种准确测定的方法，一般在梯度洗脱前采用衍生试剂（如2，4-二硝基氟苯）进行柱前衍生。与比色法相比，此法的准确度和灵敏度较高，但操作比较复杂，对于样品多、工作量大的菌种筛选并不适用，所以试验中根据实际要求选择适当的测定方法。3L-组氨酸的代谢及相关途径调节
组氨酸的代谢途径比较复杂，要选育组氨酸高产菌株，就必须对细胞原有的代谢途径进行改造。L-组氨酸的代谢及相关途径见附图。
3.1增加前体物的合成
5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP ）不仅是组氨酸的前体物也是嘌呤和嘧啶的前体物，而且ATP 还直接参与组氨酸的合成，利用嘌呤的结构类似物来解除反馈调节，增加组氨酸前体物的积累。3.2增强HMP 途径的流量
根据EMP 和HMP 途径的调节得出，选育能以HMP 途径上的代谢产物为碳源且生长良好的菌株可以达到增加HMP 途径流量的目的。通过削弱EMP 途径也能增加HMP 途径的流量，进而增加组氨酸的产量。3.3阻断转酮酶
由附图可知，5-磷酸核糖也是5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP ）的重要来源。而PRPP 是组氨酸的前体物，转酮酶
活性丧失，导致HMP 戊糖分子重排阶段中的转酮酶催化的反应被阻断，进而大量积累5-磷酸核糖，通过选育莽草酸缺陷型突变株，可成功分离出转酮酶缺陷突变株，使得L-组氨酸产量提高[15]。3.4解除组氨酸的反馈调节
在组氨酸的合成途径中，磷酸核糖-ATP 焦磷酸化酶是限速酶[7]，
组氨酸对其既反馈抑制又反馈阻遏，一般通过选育专属解除组氨酸对其反馈调节的结构类似物来完成；同时组氨酸对其合成途径上的其他酶也有抑制或阻遏作用，通过选育其他一些组氨酸结构类似物来逐步解除反馈调节。
3.5阻断组氨酸的分解
组氨酸酶又称组氨酸解氨酶，能把L-组氨酸脱氨形成尿刊酸，再通过一系列反应生成谷氨酸。选育在以组氨酸为主要或唯一氮源的基本培养基上生长微弱或不能生长的细胞，则能形成组氨酸酶缺陷型。4国内外对L-组氨酸高产菌株选育的研究
通过对L-组氨酸生物合成途径的分析，了解了其育种的基本思路，介绍近年来国内外对L-组氨酸高产菌株选育的研究，希望对进一步研究有一定帮助。4.1L-组氨酸的诱变育种
顾正华等[16]以谷氨酸棒杆菌ATCC13761为出发菌，经硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变处理，获得菌株H-24，产L-组氨酸1.6g/L 。此研究基于解除反馈抑制和反馈阻遏、增加前体合成与切断产物代谢途径3方面考虑，使组氨酸有较大的积累。后又经过多次诱变筛选得到多重遗传标志的菌株DH-8，
产酸2.1g/L 。另外选育能在D-葡萄糖酸基本培养基上生长的突变株，也能提高产酸[17]。添加柠檬酸能增加HMP 途径的代谢流量，同样能提高产酸。由于芳香族氨基酸对PRPP 激酶有抑制作用，
可以通过筛选莽草酸缺陷型菌株来降低芳香族氨基酸的代谢流量，进而增加流向PRPP 的通量。于是利用亚硝基胍诱变谷氨酸棒杆菌
HZ4221，选育得到莽草酸缺陷型的渗漏突变株CLW0560，积累L-组氨酸达5.31g/L [15]。如果进一步研究5L 发酵罐发酵动力学及发酵条件优化，将能使组氨酸得到更大积累，对工业化生产具有重要的指导作用[18]。
曾莹等[20]对L-组氨酸选育方面也做了大量的研究，采用HNO 2和紫外线复合诱变处理黄色短杆菌，
选育得到一株高产菌，产L-组氨酸128.28mg/L 。虽然该菌株产酸水平比较低，但可以在此基础上定向选育结构类似物抗性突变株及营养缺陷型菌株，打破代谢调节机制。利用硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变处理谷氨酸棒杆菌S 9114，最终得到一正
突变株S6（D-his r
），可积累L-组氨酸327mg/L [21]。首先对其
进行最佳发酵工艺的研究，确定了菌株的最佳发酵条件[22]，继续对S6进行了一系列的诱变处理，
经亚硝酸钠和紫外线
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复合诱变，所得菌株F6产L-组氨酸量为330mg/L[23]。进行多次亚硝基胍的反复诱变。最终得到一株N
13
（MY r），可积累L-组氨酸561mg/L[24]。虽然与张伟国等的研究相比，产酸水平较低，可能与所用出发菌的细胞特性存在差异有关，但方法仍具有很好的参考价值。可以考虑赋予菌株多重抗性，使产组氨酸更加通畅并能大量积累[25-26]。
4.2L-组氨酸的基因工程育种
随着基因工程的发展，人们开始利用其进行菌株改造，以大幅度提高组氨酸的产量。杉浦等[27]将粘质赛氏杆菌MPr90的DNA与pLG339（Km r）相连接，用pKT1124（Km r Ap r）进行亚克隆获得pSS503。最后将pSS503导入组氨酸生产菌MPr90，组氨酸产量从23g/L提高为36g/L。仓桥修等[28]用亚硝基胍诱变枯草芽孢杆菌AJ11733，得到组氨酸缺陷型菌株AJ11732。制备AJ11732的感受态细胞，从菌株AJ11733中提取DNA片段。加入到以上感受态细胞悬浊液中，培养得到组氨酸产生菌AJ11734。再从AJ11734中提取带有组氨酸合成及组氨酸抗性的遗传基因，插入原菌株AJ11733中，得到新型组氨酸产生菌AJ11735，产酸水平从11g/L提高到23g/L。
5展望
氨基酸输液已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年增加，而L-组氨酸是氨基酸输液必不可少的氨基酸品种之一。目前急需L-组氨酸的投产并形成生产规模以加快氨基酸品种的配套工作。发酵法生产L-组氨酸的进展比较缓慢，日本于20世纪70年代中期曾进行这方面的研究，但在80年代后就未见新的报道，国内对此研究也较少，仅仅处在实验室研究阶段。
近年来，随着发酵工业的发展，有关组氨酸发酵的研究又逐渐升温，人们利用代谢控制发酵理论进行工业微生物的育种工作，取得了一定进展。但组氨酸的生物合成途径比较复杂，且测定方法存在一些困难，所以寻找L-组氨酸的高产菌株是一项重要而艰巨的工作。在选育抗结构类似物时需赋予菌株多重抗性，使组氨酸积累更加舒畅。多层次多尺度的进行代谢工程研究已成为必然的发展趋势。
国外利用基因工程对L-组氨酸的产生菌进行改造，大幅度提高了组氨酸的产酸水平，基因工程的引入使L-组氨酸的产量远远高于传统的诱变育种，基因工程与代谢工程相结合已成为组氨酸育种的新方向。
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0401肉制品生产许可证审查细则(XXXX版)
0401肉制品生产许可证审查细则（2006版） 发布日期：2011-05-06 来源：质检总局浏览次数：1459 实施食品生产许可证管理的肉制品是指以鲜、冻畜禽肉为主要原料，经选料、修整、腌制、调味、成型、熟化（或不熟化）和包装等工艺制成的肉类加工食品。肉制品的申证单元为5个，肉制品生产许可证有效期为3年，其产品类别编号为0401。 《关于印发食用植物油等26个食品生产许可证审查细则的通知》（2006年12月27 日国质检食监〔2006〕646号） 一、发证产品范围及申证单元 实施食品生产许可证管理的肉制品是指以鲜、冻畜禽肉为主要原料，经选料、修整、腌制、调味、成型、熟化（或不熟化）和包装等工艺制成的肉类加工食品。 肉制品的申证单元为5个：腌腊肉制品；酱卤肉制品；熏烧烤肉制品；熏煮香肠火腿制品；发酵肉制品。
腌腊肉制品申证单元包括咸肉类、腊肉类、风干肉类、中国腊肠类、中国火腿类、生培根类和生香肠类等；酱卤肉制品申证单元包括白煮肉类、酱卤肉类、肉糕类、肉冻类、油炸肉类、肉松类和肉干类等；熏烧烤肉制品申证单元包括熏烧烤肉类、肉脯类和熟培根类等；熏煮香肠火腿制品申证单元包括熏煮香肠类和熏煮火腿类等；发酵肉制品申证单元包括发酵香肠类和发酵肉类等。 在生产许可证上应注明获证产品名称即肉制品及申证单元名称，即肉制品（腌腊肉制品、酱卤肉制品、熏烧烤肉制品、熏煮香肠火腿制品、发酵肉制品）。 肉制品生产许可证有效期为3年，其产品类别编号为0401。 二、基本生产流程及关键控制环节
三、必备的生产资源 （一）生产场所。 厂区应有良好的给、排水系统，厂区内不得有臭水沟、垃圾堆、坑式厕所或其他有碍卫生的场所。 厂房设计应符合从原料进入到成品出厂的生产工艺流程要求，避免交叉污染。原辅材料和成品的存放场所必须分开设置。厂房地面和墙壁应使用防水、防潮、可冲洗、无毒的材料，地面应平整，无大面积积水，明地沟应保持清洁，排水口须设网罩防鼠。地面、墙壁、门窗及天花板不得有污物聚集。加工场所应有防蝇虫设施，废弃物存放设施应便于清洗消毒，防止害虫孳生。车间人员入口应设有与人数相适应的更衣室、手清洗消毒设施和工作靴（鞋）消毒池。生产车间的厕所应设置在车间外侧，并一律为水冲式，备有手清洗消毒设施和排臭装置，其出入口不得正对车间门，要避开通道，其排污管道应与车间排水管道分设。原料冷库的温度应能保持原料肉冻结，成品库的温度应符合产品明示的保存条件。 1. 腌腊肉制品 应具有原料冷库、辅料库，有原料解冻、选料、修整、配料、腌制车间、包装车间和成品库。
代谢控制发酵试题库
1脱敏作用：变构酶经特定处理后，不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性。 2分解代谢物阻遏：当细胞具有一优先利用的底物时，很多其他分解反应途径受到阻遏 3限量补充培养法：将经适当稀释的浓缩处理液涂布于含有微量蛋白胨或0.1%完全培养基成分的基本培养基平板上。经培养后，野生型细胞迅速生长成较大菌落，而缺陷型细胞生长缓慢只能形成小菌落。这些小菌落大多数为营养缺陷型，将其转接到完全培养基斜面保存待测。 5代谢互锁:从生物合成途径来看，酶受一种与此代谢途径完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制(阻遏)作用是部分性的，不完全的。 6代谢工程:应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作。 7积累反馈抑制:每个分支途径的末端产物都独立于其他末端产物，以一定百分比控制该途径第一个共同的酶所催化的反应。当几个末端产物同时存在时，它们对酶反应的抑制是累积的。各末端产物之间既无协同效应，也无拮抗作用。 8原生质融合:是一个人工实验系统，将遗传性状不同的两个细胞融合，通过基因重组，形成有新的、优良性状的新细胞的过程。 9转导:利用转导噬菌体为媒介而将供体菌的部分DNA导入受体菌中，从而使受体菌获得部分遗传性状的现象。 10营养缺陷型：指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。 11基因工程：指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 12诱变：指利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质(主要是DNA)的结构发生改变，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。 13.转化：指相当大的游离的供体细胞的DNA片段被直接吸收到受体细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。 14合作反馈抑制：当任何一种终产物单独过剩时，只部分的反馈抑制第一个酶的活性，只有当终产物同时过剩存在时，才能引起强烈抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和 15增强子：指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列（能强化转录起始的一段DNA序列）。 16回复突变株：由突变型菌株经再突变而恢复原初野生型性状的菌株。 17渗漏突变型：指因突变所产生的不完全遗传障碍，其基因所控制的反应程度不象野生型，但多少还能进行，称这种现象为渗漏，具有这种性质的突变型就称为渗漏突变型
发酵肉制品
第一节发酵肉制品的概念和种类 世界上每年的肉类消费总量已超过2亿吨，深加工肉制品占肉类总产量的30%以上，其中发酵肉制品占据重要地位。 我国肉类的年总产量已达到6000万吨，但是深加工仅占总产量的4%，微生物定向接种的发酵肉制品市场上还不多。发酵肉制品的研究和应用在我国还属于一个新兴的研究领域。 一、发酵肉制品的概念 发酵肉制品是指在自然或人工控制条件下利用微生物发酵作用，产生具有特殊风味、色泽和质地，且具有较长保存期的肉制品。因肉制品在加工过程中经过了生物发酵，由特殊细菌或酵母，将糖转化为各种酸和(或)醇，使肉制品的pH值降低，并经低温脱水使Aw下降，因此，准确地讲应称其为发酵干燥肉制品。 二、发酵肉制品的种类 1、种类：发酵香肠和发酵干火腿 （1）发酵香肠是指将绞碎的肉(通常指猪肉或牛肉)、动物脂肪、盐、糖、发酵剂和香辛料等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有稳定的微生物特性和典型的发酵香味的肉制品。 2、分类依据：酸性（pH值）高低、原料形态（绞碎或不绞碎）、发 酵方法（有无接种微生物或/和添加碳水化合物）、表面有无霉菌生长、脱水的程度、以地名进行命名。 （1）按脱水程度 ①半干发酵香肠（40-45%）
②干香肠（ 25-40% ） （2）根据发酵程度 ①低酸发酵肉制品（pH≥ ②高酸发酵肉制品（pH＜ （3）按地名: ①黎巴嫩大香肠 ②塞尔维拉特香肠 ③萨拉米香肠 三、发酵肉制品的特点 1. 微生物安全性:pH<….控制金黄色葡萄球菌 2. 货架期 :货架期一般较长。一类是pH在以下，水分活性在以下； 另一类是pH低于，水分活性低于。 3. 营养特性 :亚硝基化合物、多环芳香烃、热解物质等致癌物质甚少，风味独特。 四、微生物在发酵肉制品中的作用 1、降低pH值减少腐败改善组织与风味 2、促进发色 3、防止氧化变色 4、减少亚硝胺的生成 5、抑制病原微生物的生长及其产生的毒素 五、产品的安全性与质量控制 （一）肉中的金黄色葡萄球菌可能在发酵产酸之前或当中生长并
高产蛋白酶菌株的选育.总结
课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法 武汉轻工大学食品学院王宏勋 一、课堂报告依据的知识背景 1、遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。 PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。
1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。 2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。 3、基因和性状 1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定——基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。
微生物代谢工程
微生物代谢工程 1.代谢控制发酵 代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。 代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。 2.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段 定义：应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。 研究内容： (1)代谢流的定量和定向 (2)细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析 (3)研究胞内代谢物浓度的反应工程方法 (4)用13C标记实验进行胞内稳态流分析 研究手段 (1)采用遗传学手段的遗传操作 ①基因工程技术的应用。②常规诱变技术的应用。 (2)生物合成途径的代谢调控 ①生物合成中间产物的定量生物测定。②共合成法在生物合成中的应用。③酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏。④无机磷对生物合成的调节。 (3)研究生物合成机制的常用方法 ①刺激实验法。②同位素示踪法。③洗涤菌丝悬浮法。④无细胞抽提法。⑤遗传特性诱变法。 3. 工业发酵的五字策略（图示加文字说明） ①进，在育种和发酵控制方面都要促进细胞对碳源营养物质的吸收； ②通，在育种方面解除对某些酶的反馈调节，在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外海包括其他支持生物合成的物流）能够畅通的注入载流途径，汇入代谢主流，流向目的产物，特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径通畅，代谢主流优势明显 ③节，采用育种或发酵控制手段，节制与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的“节制”是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或以中间产物为起始底物的分支途径； ④堵，采用育种或发酵手段消除或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢，为了消除或削弱目的产物的进一步分解代谢，就必须降解目的产物进一步代谢的酶活力或酶量，甚至使这些酶不再合成或不起作用； ⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。在育种和发酵控制发面可通过调节细胞对目的产物的通透性，增加输送目的产物的载体蛋白的量，为目的产物输送代谢能的方法，使目的产物尽快转移出细胞。 4. 酶的阻遏机制，以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明（图示加文字说明） 终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制反馈阻遏：
赖氨酸高产菌株的选育
赖氨酸高产菌株的选育 摘要：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。 关键词：赖氨酸，菌种选育，基因改造，高通量筛选 Breeding of high-yielding lysine producers Abstract:L-lysine as an important amino acid for livestock has been increasing in demand, all traditional lysine producers have been created over many years by multiple rounds of random mutagenesis and selection. In recent decades, the development of recombinant DNA techniques and increased understanding of the biochemistry of metabolic reactions has enabled the identification of genetic targets for improved lysine production,and the successful optimization of a wild-type strain into a high-producing cell factory may serve as foundation to combine rational design of metabolic blueprints with targeted genetic engineering and integrated omics analysis for engineering microbial metabolism. Here, we describe the development of a genetically defined process of L-lysine hyperproducing by systems metabolic engineering of the wildtype and the method combining with high throughput screening (HTS) permits the efficient and rapid cloning of rarely transcribed differentially expressed genes. The experimental strategy virtually excludes the possibility of isolating false positive clones. Keywords: Lysine, Strain optimization, Genetic modification, High throughput screening L-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。随着L-赖氨酸的需求量急剧增加，L-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
肉制品食品添加剂最大使用量GB2760
肉质品食品添加剂功能及最大使用量 1,氨基乙酸( 又名甘氨酸) 功能增味剂 预制肉制品最大使用量 3.0g/kg 熟肉制品最大使用量 3.0g/kg 2,茶多酚( 又名维多酚) 功能抗氧化剂 腌腊肉制品类 ( 如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠) 0.4g/kg 以油脂中儿茶素计 酱卤肉制品类 0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 熏、烧、烤肉类0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 油炸肉类0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 西式火腿 ( 熏烤、烟熏、蒸煮火腿)类0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 肉灌肠类0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 发酵肉制品类0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 预制水产品( 半成品) 0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 熟制水产品( 可直接食用) 0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 水产品罐头0.3g/kg 以油脂中儿茶素计 3,赤藓红及其铝色淀功能着色剂 肉灌肠类0.015g/kg 以赤藓红计肉罐头类0.015g/kg 以赤藓红计 4,刺云实胶功能增稠剂 预制肉制品 10.0g/kg 熟肉制品10.0g/kg 5,单辛酸甘油酯功能防腐剂 肉灌肠类 0.5 g/kg 6,丁基羟基茴香醚( B H A) 功能抗氧化剂 腌腊肉制品类 ( 如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠)0.2g/kg 以油脂中的含量计 风干、烘干、压干等水产品0.2g/kg以油脂中的含量计 7,二丁基羟基甲苯( B H T )功能抗氧化剂 腌腊肉制品类 ( 如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠) 0.2g/kg 以油脂中的含量计 风干、烘干、压干等水产品0.2g/kg以油脂中的含量计
8,富马酸一钠功能酸度调节剂 肉及肉制品 ( 0 8 . 0 1 生、鲜肉类除外) 按生产需要适量使用 水产及其制品( 包括鱼类、甲壳类、贝类、软体类、棘皮类等水产及其加工制品等) ( 0 9 . 0 1鲜水产除外) 按生产需要适量使用 9，甘草抗氧化物功能抗氧化剂 腌腊肉制品类 ( 如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠)0.2g/kg以甘草酸计 酱卤肉制品类0.2g/kg以甘草酸计 熏、烧、烤肉类0.2g/kg 以甘草酸计 油炸肉类0.2g/kg 以甘草酸计 西式火腿 ( 熏烤、烟熏、蒸煮火腿) 类0.2g/kg以甘草酸计 肉灌肠类0.2g/kg 以甘草酸计 发酵肉制品类0.2g/kg以甘草酸计 腌制水产品0.2g/kg 以甘草酸计 10,红曲米, 红曲红功能着色剂 腌腊肉制品类 ( 如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠)按生产需要适量使用 熟肉制品按生产需要适量使用 11，β - 胡萝卜素功能着色剂 熟肉制品0.02g/kg 肉制品的可食用动物肠衣类5.0 g/kg 冷冻鱼糜制品( 包括鱼丸等) 1.0 g/kg 预制水产品( 半成品) 1.0 g/kg 熟制水产品( 可直接食用) 1.0 g/kg 水产品罐头 0.5 g/kg 12,ε - 聚赖氨酸功能防腐剂 熟肉制品 0.25g/kg 13,ε - 聚赖氨酸盐酸盐功能防腐剂 肉及肉制品 0.30 g/kg
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
组氨酸代谢控制发酵
组氨酸代谢控制发酵 11生工（1）班郝瑶 20110801111 摘要：L-组氨酸是含咪唑核的碱性氨基酸，是人体和动物体内的半必需氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，应用广泛，尤其在医药领域中的应用日益受到重视，是市场上急需的氨基酸品种之一。文中简要介绍了发酵法生产L-组氨酸及产物检测方法，通过对L-组氨酸生物合成途径的分析指出了大量合成L-组氨酸的关键控制点及选育的基本思路，并重点概括了国内外对L-组氨酸高产菌株选育方案的研究。 关键词：L-组氨酸；发酵；代谢途径；选育方法 引言 L-组氨酸（L-Histidine）化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸[1]。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业。尤其在医药领域的作用日益受到重视，目前，其主要应用于氨基酸输液及综合氨基酸制剂方面，已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年递增。但目前L-组氨酸生产的先进技术主要掌握在欧、美、日等发达国家手里，主要采用发酵法。日本在20世纪70年代就开展发酵生产组氨酸的研究，而国内在这方面还仅处于实验室研究阶段[2-3]。因此加快研究发酵法生产L-组氨酸具有非常重要的意义。 1发酵法生产L-组氨酸 发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对组氨酸产生菌进行诱变，选育出营养缺陷型及组氨酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累L-组氨酸的目的[4]。其具有原料成本低，反应条件温和极易实现大规模生产等优点，是一种非常经济有效的生产方法[5]。 1.1L-组氨酸的产生菌 目前发现的组氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌和粘质赛氏杆菌。已投入工业化生产的有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和粘质塞氏杆菌，其产酸水平分别为15.4g/L、12.5g/L和17.0g/L，糖酸转化率分别为15.4%、12.5%、10.0%[6]。 1.2发酵过程中pH值的控制 大部分组氨酸发酵培养基中的氮源是硫酸铵，当铵离子被利用之后，剩余的硫酸根离子会导致发酵液的pH值下降，从而对发酵产生影响。可以考虑在发酵培养基中添加碳酸钙，因为碳酸钙可以中和硫酸根离子，通过优化试验确定碳酸钙的最佳添加量。 1.3生物素对L-组氨酸发酵的影响 作为L-组氨酸的主要产生菌，谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型菌，生物素是细胞生长的必需因子，同时还是多种羧化酶的辅酶，在CO2固定反应中起重要作用，可影响糖酵解速度，改变发酵代谢流向。添加适量的生物素可以增加单磷酸己糖支路（HMP）途径的代谢流量，有利于L-组氨酸的产生[7]。
高产胞外蛋白酶正文
高产胞外蛋白酶菌株的选育生命科学学院生物科学0901班王亚云 2009044020119 摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；诱变；鉴定 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基： 1.1. 2.1 筛选培养基： 酪素培养基 1.1. 2.2营养培养基： 肉汤培养基 1.1. 2.3鉴别性培养基 （1）淀粉培养基 （2）明胶培养基
（3）葡萄糖发酵培养基 （4）葡萄糖蛋白胨培养基 乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。 1.2 方法 1.2.1 菌种的筛选 1.2.1.1 培养基的配置及灭菌 按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。 1.2.1.2 涂布分离 称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化 观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。 将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备 在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep 管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变
代谢控制发酵试题库
代谢控制发酵试题库 名词解释 1.代谢工程指应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。 2.积累反馈抑制指每个分支途径的末端产物都独立于其他末端产物，以一定百分比控制该途径第一个共同的酶所催化的反应。当几个末端产物同时存在时，它们对酶反应的抑制是累积的。各末端产物之间既无协同效应，也无拮抗作用。 3.代谢互锁指从生物合成途径来看，酶受一种与此代谢途径完全无关的终产物的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制(阻遏)作用是部分性的，不完全的。 4.原生质融合指是一个人工实验系统，是将遗传性状不同的两个细胞融合，通过基因重组，形成具有新的、优良性状的新细胞的过程。 5.转导指利用转导噬菌体为媒介而将供体菌的部分DNA导入受体菌中，从而使受体菌获得部分遗传性状的现象。 6.代谢控制发酵：是指利用遗传学方法或其它生物化学方法，人为地在脱氧核苷酸（DNA）的分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用目的产物大量生成、积累的发酵。 7.营养缺陷型：指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。 8.基因工程：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 9.诱变：指利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质(主要是DNA)的结构发生改变，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。 10.转化：指相当大的游离的供体细胞的DNA片段被直接吸收到受体细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。 11.合作反馈抑制：指当任何一种终产物单独过剩时，只部分的反馈抑制第一个酶的活性，只有当终产物同时过剩存在时，才能引起强烈抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和。12.分子克隆：指对目的DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。 判断 1.转化和转导都是将外源基因导入受体细胞的方法，只是受体存在差异。 ×，转导需要载体，而转化不需要载体。 2.紫外线照射后的菌悬液，不能移至可见光下进行筛选和检出。 √，由于光复活作用，不能移至可见光下 3.酶的诱导和酶的阻遏都是指终产物对酶合成过程的促进或阻碍。 ×，酶诱导是底物对酶合成的促进，酶阻遏是产物对酶合成的抑制 4.一个操纵子中的结构基因通过转录、转译控制蛋白质的合成，而操纵基因和启动基因通过转录、转译控制结构基因的表达。 ×，操纵基因和启动基因只起调节作用，本身不表达。 5.诱变处理的菌液进行中间培养主要是为了克服表型延迟。 √，解释表型延迟。 6.转化和转导都是将外源基因导入受体细胞的方法，只是供体存在差异。
柠檬酸高产菌株选育
柠檬酸高产菌株的选育 222011********* 刘亚超 2011级生物技术 关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵 摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。 引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌种 以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。 1.1.2培养基 分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。 1.1.3 试剂及仪器 3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离纯化 用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。 1.2.2 初筛 用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。取各个不
发酵调控学完整版
发酵调控学 生物工程学院 储炬 课程内容 1 微生物生长分化调节的规律 (1)细胞周期内有关生长的活动，DNA合成与细胞分裂的调节 (2)丝状菌生长分化的调节 2 初级代谢的调节机制 (1)调节的生化基础 (2)代谢调节的方式与内容：诱导、分解代谢物调节、反馈调节 课程内容 3 次级代谢物的生物合成的调节 (1)次级代谢物的概念 (2)生物合成的前体 (3)次级代谢物的生物合成 (4)抗生素生物合成的控制 课程内容 4 发酵过程控制 (1)控制的策略 (2)参数的指导作用 (3)参数相关分析 (4)过程控制的评价 主要参考书 ?现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化学工业出版社，北京。2002年1月?Biotechnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JB ?Biotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing. Rehm H-JB 微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术 ?代谢调控是研究内在的调节机制，而过程优化则是外在控制，是建立在相关参数的分析上的，这两个方向相辅相成，前者为后者的基础，而后者是使理论变为现实的手段。 1微生物生长与调节 为了控制菌体的生长，需要了解生长的方式，细胞分裂和调节的规律，测量微生物生长的各种办法，微生物生长繁殖的形式与工业生产的关系，环境变化对微生物生长的影响。因此，研究微生物的生长分化规律无疑是发酵调控原理的一个重要组成部分。 细胞周期 对于个体细胞行为，主要关心 ?染色体启动、复制和分离 ?新细胞壁材料的合成与插入 ?协调染色体复制和细胞分裂的信号 细胞周期 细胞周期(Cell cycle)： 细胞的一系列可鉴别的周而复始的生长活动。这些活动的顺序不变, 完成一个活动后才能进行下一个活动。 图1 细胞周期 细胞周期
碱性蛋白酶菌株的分离鉴定
产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定 摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。 关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定 Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing Strains Wensi Hou (Yanshan university , Liren college , Hebei 066004) Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect. Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification 1．碱性蛋白酶 1.1简介 碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 1.2碱性蛋白酶的理化性质 微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60℃以下。 碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活性基团,因此,一些金属离子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)
发酵优化与控制
发酵过程的优化与控制 1.举例说明反馈控制系统是如何工作、间接优化发酵性能的。 答：以《应用溶氧反馈控制高密度培养重组大肠杆菌过程中乙酸的产生》为例简介如下： 在供氧充足的条件下，当大肠杆菌比摄糖速率q g≥临界值q g crit时(图1A)，就会产生乙酸，溶氧信号pO2在产生乙酸时为图1B中的2，不产生乙酸为图1B中的1； 在葡萄糖限制培养的条件下，脉冲补入葡萄糖，当q g≤q g crit时，大肠杆菌比摄氧速率q o升高，pO2值降低。 脉冲过后，葡萄糖浓度的下降，q g下降，pO2值也逐渐回升(图1B)。 当脉冲补入的葡萄糖过多，大肠杆菌的摄糖速率超过临界值时，大肠杆菌的摄氧能力处于饱和状态，pO2值的响应就不会随着葡萄糖的脉冲补入而产生振荡变化(图1B)。 如图：在补料的前阶段(15~28h)，以对数增加的流速补入葡萄糖时，pO2值随着葡萄糖脉冲补入而上下振荡；加入IPTG开始诱导(26h)重组大肠杆菌表达人表皮生长因子后，在接近30h时，振荡的幅度变小，这标志着重组菌的比摄糖速率逐渐接近产生乙酸的临界比摄糖糖速率(q g crit)，而此后降低补料速率则又使pO2的振荡幅度有所增加。根据pO2值的振荡变化来控制葡萄糖的补料速率(30~44h)，能使重组大肠杆菌继续保持较高的生长速率，同时发酵液中的乙酸和葡萄糖的浓度也维持在较低的水平，大肠杆菌的细胞干重在44h时达到48g/L，人表皮生长因子的表达量比第二批提高45％。
2、实现发酵过程优化的目标有哪些？如何根据发酵过程的特点实现这些目标 的相对统一？举一例进行表述。 答： ⑴实现发酵过程优化的目标： 使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能的简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行，以达到高产量（提高设备利用率；降低产品提取费用），高转化率（降低原料成本；减少环境污染），高生产强度（缩短生产周期；降低设备投资）的目的。 ⑵举例说明实现发酵目标相对统一：《L-组氨酸发酵优化》 ①L-组氨酸测定方法的研究 产物的快速测定，可以帮助生产者及时知道发酵过程进行的水平。快速测定方法的建立不仅给生产带来方便，也节约了生产成本。 本研究中应用“Paully试剂比色法”对发酵液中L-组氨酸进行了定量分析研究，确立了L-组氨酸定量测定条件和计算方法，并对其精确度进行研究，证明Paully试剂比色法能够快速，准确的测定发酵液中L-组氨酸含量。 ②L-组氨酸发酵条件的优化 组氨酸工业优生产的关键是发酵，发酵水平的高低是决定产品成本的主要因素。提离发酵水平的途径有二条：一是选育适合工业化生产的优良菌种，二是获得与生产菌种相匹配的最佳发酵工艺条件和控制手段。前者是建立在代谢控制发酵研究基础上的现代菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵过程技术。只有二者紧密结合才能最终实现发酵生产的高水平。 本研究中进行了分批发酵和补料分批发酵的条件优化，通过研究培养方式、营养条件控制、无机盐影响、生长因子影响以及环境条件控制对于L-组氨酸发酵的影响，从而提高了组氨酸的产量。 如图3-1所示为不同碳源对种子培养基的影响，从种子活力分析，以葡萄糖和果糖作为碳源，菌体浓度较高，而蔗糖作为碳源时种子活力最低。从产酸角度看，蔗糖产酸最高，葡
肉制品生产许可证(SC)审查细则
生产许可证 新法的相关消息（P1）及详细的肉制品生产许可证审查细则（P2-P14） 新修订的《食品安全法》于2015年10月1日起施行，作为新《食品安全法》的配套规章，国家食品药品监督管理总局制定的《食品生产许可管理办法》（以下简称《办法》）也同步实施。那么《办法》实施后，对食品生产企业、消费者来说有哪些改变？一起来看看。 新《办法》变化：五取消、四调整、四加强 上述相关人士透露，新《办法》最主要的变化概括起来主要是“五取消”“四调整”“四加强”。 “五取消”指： 一是取消部分前置审批材料核查； 二是取消许可检验机构指定； 三是取消食品生产许可审查收费； 四是取消委托加工备案； 五是取消企业年检和年度报告制度。 “四调整”指： 一是调整食品生产许可主体，实行一企一证； 二是调整许可证书有效期限，将食品生产许可证书由原来3年的有效期限延长至5年； 三是调整现场核查内容； 四是调整审批权限，除婴幼儿配方乳粉、特殊医学用途食品、保健食品等重点食品原则上由省级食品药品监督管理部门组织生产许可审查外，其余食品的生产许可审批权限可以下放到市、县级食品生产监管部门。 “四加强”指： 一是加强许可档案管理； 二是加强证后监督检查； 三是加强审查员队伍管理； 四是加强信息化建设
一、发证产品范围及申证单元 实施食品生产许可证管理的肉制品是指以鲜、冻畜禽肉为主要原料，经选料、修整、腌制、调味、成型、熟化（或不熟化）和包装等工艺制成的肉类加工食品。 肉制品的申证单元为5个：腌腊肉制品；酱卤肉制品；熏烧烤肉制品；熏煮香肠火腿制品；发酵肉制品。腌腊肉制品申证单元包括咸肉类、腊肉类、风干肉类、中国腊肠类、中国火腿类、生培根类和生香肠类等；酱卤肉制品申证单元包括白煮肉类、酱卤肉类、肉糕类、肉冻类、油炸肉类、肉松类和肉干类等；熏烧烤肉制品申证单元包括熏烧烤肉类、肉脯类和熟培根类等；熏煮香肠火腿制品申证单元包括熏煮香肠类和熏煮火腿类等；发酵肉制品申证单元包括发酵香肠类和发酵肉类等。 在生产许可证上应注明获证产品名称即肉制品及申证单元名称，即肉制品（腌腊肉制品、酱卤肉制品、熏烧烤肉制品、熏煮香肠火腿制品、发酵肉制品）。 肉制品生产许可证有效期为3年，其产品类别编号为0401。 二、基本生产流程及关键控制环节