组氨酸发酵条件及高产菌株选育研究进展

2010No．9Serial No．222China BrewingL-组氨酸（L-Histidine ）化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸[1]。

L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业。

尤其在医药领域的作用日益受到重视，目前，其主要应用于氨基酸输液及综合氨基酸制剂方面，已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年递增。

但目前L-组氨酸生产的先进技术主要掌握在欧、美、日等发达国家手里，主要采用发酵法。

日本在20世纪70年代就开展发酵生产组氨酸的研究，而国内在这方面还仅处于实验室研究阶段[2-3]。

因此加快研究发酵法生产L-组氨酸具有非常重要的意义。

1发酵法生产L-组氨酸发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对组氨酸产生菌进行诱变，选育出营养缺陷型及组氨酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累L-组氨酸的目的[4-5]。

其具有原料成本低，反应条件温和极易实现大规模生产等优点，是一种非常经济有效的生产方法[6]。

1.1L-组氨酸的产生菌目前发现的组氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌和粘质赛氏杆菌。

已投入工业化生产的有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和粘质塞氏杆菌，其产酸水平分别为15.4g/L 、12.5g/L 和17.0g/L ，糖酸转化率分别为15.4%、12.5%、10.0%[7]。

1.2发酵过程中pH 值的控制大部分组氨酸发酵培养基中的氮源是硫酸铵，当铵离子被利用之后，剩余的硫酸根离子会导致发酵液的pH 值下降，从而对发酵产生影响。

可以考虑在发酵培养基中添加碳酸钙，因为碳酸钙可以中和硫酸根离子，通过优化试验确定碳酸钙的最佳添加量。

1.3生物素对L-组氨酸发酵的影响作为L-组氨酸的主要产生菌，谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型菌，生物素是细胞生长的必需因子，同时还是多种羧化酶的辅酶，在CO 2固定反应中起重要作用，可影响糖酵解速度，改变发酵代谢流向。

添加适量的生物素可以增加单磷酸己糖支路（HMP ）途径的代谢流量，有利于L-组氨酸的产生[8]。

1.4柠檬酸钠对L-组氨酸发酵的影响在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A 的代谢流分布，保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP 之间代谢流量平衡[9-11]。

在发酵培养基中添加适量的柠檬酸钠后葡萄糖的酵解途径EMP 被抑制，使碳架流向HMP 途径，有利于组氨酸的生成[12]。

影响组氨酸发酵的因素还有许多，可以通过正交试验或响应面法进行优化试验。

2L-组氨酸的测定方法对L-组氨酸含量测定的研究较少，建立一种简便可行的测定方法，对组氨酸的生产具有指导意义。

目前较常用组氨酸发酵条件及高产菌株选育研究进展孙希叶，杨平平，李旋，王燕*（山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353）摘要：L-组氨酸是含咪唑核的碱性氨基酸，是人体和动物体内的半必需氨基酸。

L-组氨酸具有多种生理功能，应用广泛，尤其在医药领域中的应用日益受到重视，是市场上急需的氨基酸品种之一。

文中简要介绍了发酵法生产L-组氨酸及产物检测方法，通过对L-组氨酸生物合成途径的分析指出了大量合成L-组氨酸的关键控制点及选育的基本思路，并重点概括了国内外对L-组氨酸高产菌株选育方案的研究。

关键词：L-组氨酸；发酵；代谢途径；选育方法中图分类号：TQ922文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）09-0028-03Study Progress of fermentation conditions of L-histidine and screening of high productive strainSUN Xiye,YANG Pingping,LI Xuan,WANG Yan*(College of Food and Biological Engineering,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China)Abstract:L-histidine is an alkalescency amino acid with an imidazole core.It's a semi-essential amino acid in human and animals.L-histidine has a variety of physiological functions,and has been widely used,especially in the field of medicine.It is one of the urgently needed amino acid on the market.Production of L-histidine by fermentation and concerned detecting methods was briefly introduced.Critical control points of high-level synthesis of L-histidine and the basic idea for screening of strains were summarized after analysis of biosynthetic pathways L-histidine,and approaches to screening of strains were emphasized,as well.Key words:L-histidine;fermentation;metabolic pathway;screening approaches收稿日期：2009-11-22作者简介：孙希叶（1986-）女，山东临沂人，在读硕士研究生，研究方向为微生物资源开发；王燕*，教授，通讯作者。

Forum and Summary28··中国酿造2010年第9期总第222期的有比色法和高效液相色谱法。

比色法是测定组氨酸含量的简便方法，Pauly 比色法简单、快速，准确性也比较好，对仪器的要求也不高，比较适用于工业生产中组氨酸的快速测定[13]。

但试验证明此法受铵离子的影响较大，铵离子与Pauly 试剂反应呈黄色，会将组氨酸的橙红色覆盖掉。

另外茚三酮显色-分光光度法也是一种常用的比色法，该法易于实现、精密度较好，适合在菌种选育过程中定性、定量测定发酵液中的L-组氨酸[14]。

高效液相色谱法是一种准确测定的方法，一般在梯度洗脱前采用衍生试剂（如2，4-二硝基氟苯）进行柱前衍生。

与比色法相比，此法的准确度和灵敏度较高，但操作比较复杂，对于样品多、工作量大的菌种筛选并不适用，所以试验中根据实际要求选择适当的测定方法。

3L-组氨酸的代谢及相关途径调节组氨酸的代谢途径比较复杂，要选育组氨酸高产菌株，就必须对细胞原有的代谢途径进行改造。

L-组氨酸的代谢及相关途径见附图。

3.1增加前体物的合成5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP ）不仅是组氨酸的前体物也是嘌呤和嘧啶的前体物，而且ATP 还直接参与组氨酸的合成，利用嘌呤的结构类似物来解除反馈调节，增加组氨酸前体物的积累。

3.2增强HMP 途径的流量根据EMP 和HMP 途径的调节得出，选育能以HMP 途径上的代谢产物为碳源且生长良好的菌株可以达到增加HMP 途径流量的目的。

通过削弱EMP 途径也能增加HMP 途径的流量，进而增加组氨酸的产量。

3.3阻断转酮酶由附图可知，5-磷酸核糖也是5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP ）的重要来源。

而PRPP 是组氨酸的前体物，转酮酶活性丧失，导致HMP 戊糖分子重排阶段中的转酮酶催化的反应被阻断，进而大量积累5-磷酸核糖，通过选育莽草酸缺陷型突变株，可成功分离出转酮酶缺陷突变株，使得L-组氨酸产量提高[15]。

3.4解除组氨酸的反馈调节在组氨酸的合成途径中，磷酸核糖-ATP 焦磷酸化酶是限速酶[7]，组氨酸对其既反馈抑制又反馈阻遏，一般通过选育专属解除组氨酸对其反馈调节的结构类似物来完成；同时组氨酸对其合成途径上的其他酶也有抑制或阻遏作用，通过选育其他一些组氨酸结构类似物来逐步解除反馈调节。

3.5阻断组氨酸的分解组氨酸酶又称组氨酸解氨酶，能把L-组氨酸脱氨形成尿刊酸，再通过一系列反应生成谷氨酸。

选育在以组氨酸为主要或唯一氮源的基本培养基上生长微弱或不能生长的细胞，则能形成组氨酸酶缺陷型。

4国内外对L-组氨酸高产菌株选育的研究通过对L-组氨酸生物合成途径的分析，了解了其育种的基本思路，介绍近年来国内外对L-组氨酸高产菌株选育的研究，希望对进一步研究有一定帮助。

4.1L-组氨酸的诱变育种顾正华等[16]以谷氨酸棒杆菌ATCC13761为出发菌，经硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变处理，获得菌株H-24，产L-组氨酸1.6g/L 。

此研究基于解除反馈抑制和反馈阻遏、增加前体合成与切断产物代谢途径3方面考虑，使组氨酸有较大的积累。

后又经过多次诱变筛选得到多重遗传标志的菌株DH-8，产酸2.1g/L 。

另外选育能在D-葡萄糖酸基本培养基上生长的突变株，也能提高产酸[17]。

添加柠檬酸能增加HMP 途径的代谢流量，同样能提高产酸。

由于芳香族氨基酸对PRPP 激酶有抑制作用，可以通过筛选莽草酸缺陷型菌株来降低芳香族氨基酸的代谢流量，进而增加流向PRPP 的通量。

于是利用亚硝基胍诱变谷氨酸棒杆菌HZ4221，选育得到莽草酸缺陷型的渗漏突变株CLW0560，积累L-组氨酸达5.31g/L [15]。

如果进一步研究5L 发酵罐发酵动力学及发酵条件优化，将能使组氨酸得到更大积累，对工业化生产具有重要的指导作用[18]。

曾莹等[20]对L-组氨酸选育方面也做了大量的研究，采用HNO 2和紫外线复合诱变处理黄色短杆菌，选育得到一株高产菌，产L-组氨酸128.28mg/L 。

虽然该菌株产酸水平比较低，但可以在此基础上定向选育结构类似物抗性突变株及营养缺陷型菌株，打破代谢调节机制。

利用硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变处理谷氨酸棒杆菌S 9114，最终得到一正突变株S6（D-his r），可积累L-组氨酸327mg/L [21]。

首先对其进行最佳发酵工艺的研究，确定了菌株的最佳发酵条件[22]，继续对S6进行了一系列的诱变处理，经亚硝酸钠和紫外线专论与综述29··2010No．9Serial No．222China Brewing复合诱变，所得菌株F6产L-组氨酸量为330mg/L[23]。

进行多次亚硝基胍的反复诱变。