柠檬酸高产菌株选育

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柠檬酸

建国以来柠檬酸发酵工业回顾一、行业简介1、行业的历史柠檬酸的研究和生产已有300年的历史。

早在1784年，瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶出固体柠檬酸。

1838年，由Liebig鉴定出它是一种含有一个羟基的三元酸。

随后，在1860年意大利开始从果汁中用添加石灰乳的办法得到柠檬酸，从而进行了工业化生产。

到1913年,Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸。

1916年，美国农业部华盛顿化学局微生物研究室主任Thom和同事Currie对黑曲属的许多菌株进行过普查，发现很多菌种能产柠檬酸。

1919年，比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法生产柠檬酸。

1923年，美国Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸。

1938年，Perquin在荷兰发表论文，他将黑曲霉培养于低pH的含硫酸锌、氯化钾和氯化铵的糖溶液中获得了一些柠檬酸，对深层培养法的pH控制，提出了有力的证据。

1944年，Szucs应用纯蔗糖，在9d内发酵柠檬酸，可得到92%的产率，但因时间太长，未能投产。

1952年，Buelow和Johnson等用150g/L蔗糖培养液通入无菌空气，通气量增加，柠檬酸发酵时间可缩短，这对柠檬酸发酵条件控制，有了进一步地认识。

1952年，美国Miles公司，首先成功地采用深层发酵法工业化规模生产柠檬酸。

解放前我国柠檬酸工业是个空白. 20世纪60 年代, 天津工业微生物研究所、上海工业微生物研究所首次采用木薯为原料发酵生产柠檬酸, 并筛选培育出优秀的耐高糖、耐高柠檬酸并具抗金属离子的黑曲霉高产柠檬酸菌株, 成功实现了产业化。

1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。

为我国有机酸产业的形成与发展奠定了基础。

而后, 两个研究所又不断推出适合不同原料的高产菌株和新配方, 使浓醪高发酵指数的深层发酵工艺不断完善, 全行业通过积极引进和消化国内外先进技术和装配, 不断进行自主创新, 形成了具有中国特色的浓醪高发酵指数的深层发酵新工艺, 使得中国很快在20世纪末变成柠檬酸生产大国。

He_Ne激光复合诱变选育柠檬酸高产菌

收稿日期:2007 02 27作者简介:张建军(1970 ),男,新疆大学理论物理专业硕士生,讲师,从事离子束生物工程研究。

e mail:zjj -tea@ 。

第25卷第2期2007年4月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.25 No.2Apr.2007文章编号:1007 7383(2007)02 0225 04He Ne 激光复合诱变选育柠檬酸高产菌张建军,甘秀英,侯娟,黄旭初(石河子大学师范学院物理系,新疆石河子832003)摘要:柠檬酸产生菌黑曲霉经多次物理、化学诱变处理后会对其产生一定的抗性,在菌种改良过程中不易得到优良高产菌株。

为此,以黑曲霉(Aspergillus niger )28#为出发菌株,采用金属盐类化合物 LiCl 处理黑曲霉的孢子,然后用He Ne 激光辐照对柠檬酸发酵菌黑曲霉进行复合诱变。

结果表明,各实验组发生了明显的不同变化,说明该方法能诱发黑曲霉细胞的遗传变异,适合于菌种的改良选育。

研究采用玉米粉为原料,摇瓶发酵时间72h,发酵温度35 1 ,通过溴甲酚绿指示性平板辅助筛选和摇瓶发酵,筛选出了3株柠檬酸发酵高产突变菌株,柠檬酸产酸率提高了19.29%,转化率从87.07%提高到103.86%,其中菌株L42遗传相对稳定,可作为进一步诱变筛选的出发菌株。

关键词:黑曲霉;He Ne 激光;复合诱变;选育中图分类号:Q933 文献标识码:A目前,用于工业化生产柠檬酸的黑曲霉菌种大都经过物理和化学诱变剂的处理,不同程度地增加了黑曲霉对一些诱变剂的抗性,若再使用同样的方法则很难对现有菌种进行改良。

激光作为一种新的诱变剂,对生物体会产生热、压力、光、电磁场等多种效应,已广泛应用于微生物诱变育种,是一种在微生物遗传育种领域中极有应用前景的新型诱变因子。

朱宏莉等[1]利用He Ne 激光(波长632.8nm,功率15mW)诱变果胶酶产生菌的原生质体,获得了突变株ZH gA,其酶活为出发菌株的1.6倍。

发酵工厂菌种选育的具体方法与实验设计

食品发酵与酿造工艺学题目：发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计年级：xxxx级专业：食品科学与工程姓名：xxx学号：xxxxxxx柠檬酸的菌种选育的具体方法与实验设计微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。

而自然界现有的菌种由于其产量较低，不能直接用于生产，目前，发酵工业生产中所使用的菌种，都是经过人工选育的优良菌种。

本篇以柠檬酸的菌种选育为例，阐述发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计。

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。

我国的柠檬酸产业，较早地进入了国际市场，经过多年的努力和奋斗已成为世界第一的生产和出口大国。

特别是经历了近几年的竞争与整合，全行业的面貌大为改观。

所以柠檬酸的菌种选育对于整个行业和国家来说都尤为重要。

一．柠檬酸的菌种的具体选育方法1.取样：从腐烂水果上分离出一株柠檬酸产生菌——黑曲霉。

2.培养基的制备：2.1 分离培养基(%)：甘薯粉15%，柠檬酸l0%分装在试管内，1公斤/厘米²压力灭菌20分钟。

2.2 生长培养基：4°Be’麦芽汁，2%琼脂。

l公斤/厘米²压力灭菌15分钟。

2.3 种子培养基(%)：甘薯粉8%，献皮l%。

每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米²压力灭菌30分钟。

2.4 发酵培养基：12%甘薯粉，每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米²压力灭菌30分钟。

3.菌种培养方法：采用迥转摇床，193转/分，偏心距25毫米，31℃振荡培养，菌丝接种，接种量5%(v/v)，培养5天。

4.菌种的分离与筛选：采用酸性滤纸法，把少许试样混入分离培养基中，摇匀，倾入无菌培养皿内(内有2—3层滤纸做支持物)，31℃培养4—5天，把长出的单菌落挑入生长培养基斜面上，31℃培养4—5天，即可见到抱子。

黑曲霉产柠檬酸菌种最优发酵条件探究_胡恺夫

实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ｋ1 Ｋ
2
Ｋ3 ｋ1 ｋ2 ｋ3 Ｒ
表 3 第 1次正交实验结果分析
ＡＢＣＤ 2112产酸量 /( )
1
1
1
1
1.5 6
1
2
2
2
0.8 7
1
3
3
3
3.8 0
2
1
2
3
2
2
3
1
0.7 6 0.7 6
2
3
1
2
0.9 9
3
1
3
2
1.2 9
3
2
1
3
1.0 1
3
3
表 4 第 2次正交实验 2112培养基Ｌ9(34)的因素水平表
Ａ淀粉水平
Ｂ(ＮＨ4 )2ＳＯ4
ｐＨ
/( )
/( )
麸皮 /( )
1
22
0.3
3.5
0.6
2
19
0.2
4.0
0.4
3
16
0.1
4.5
0.2
第 7卷第 6期
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
· 149·
表 5 第 2次正交实验 2112结果及极差分析
择各因素的相应水平 , 设计正交实验表 , 进行多次出 , 实验室保藏的 11株产柠檬酸菌种在玉米淀粉
正交实验以探索菌种产酸的最优条件。
水解糖培养基中的产酸量均高于葡萄糖和蔗糖的 ,
3.3.3 发酵稳定性实验
选取产酸率较高的 2112菌株为正交实验用菌种。
对获得的菌种及其最优发酵条件进行多次发酵 3.2 正交实验

苹果渣基质柠檬酸高产菌株选育

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微生物学杂志２０年１月第２卷第６０８１８期
ＪＵＮＬＯＩＲＢＯＯＹＮｖ２０ｏ２ｏ６ＯＲＡＦＭＣＯＩＬＧｏ．０８１８Ｎ．Ｖ．
苹果渣基质柠檬酸菌株选育局严
杨保伟，盛敏，来航线ｎ，岳田利
Ｆ２、Ｇ６Ｆ３Ｇ３Ｆ２、Ｇ０等４株菌苹果渣基质柠檬酸产生能力较高，在４种不同发酵基质中产酸性能稳定。４株且菌分别经紫外线和“ｃ — 线诱变后得到的正向突变株柠檬酸产率均显著提高，变株中Ｆ２一５ｕ发０射突Ｇ６ｌ４（Ｖ）酵苹果渣后柠檬酸产率最高，ｌ．２，Ｇ３１－（发酵苹果渣酶解液后柠檬酸产率最高，２７ｇ达】３％Ｆ２ —３３）达．３ｍ／ｍ均高于现有研究报道，Ｉ，可作为不同类型苹果渣基质柠檬酸发酵用菌种。关键词苹果渣；曲霉；檬酸；黑柠菌种选育中图分类号Ｔ２１３Ｓ０．文献标识码Ａ文章编号１０７２（０８００２００５— ０１２０）６— ０４— ６
ｓｌｉｎａｅｍｅａｉｎｓｂｓｒｔｏｕｔｓｆｒｎｔｔｏｕｔａｅ．ａｂｔｉｄｃｔｉｃｄｈｇ —ｙｅｄｎｇｓｒｉｒｃｅｎｄｂｒｅｉｇａｔｒｍｕａｏｎｄ４ｏａｎｅｉｃａｉｉｈｒｉｌｉｔａｎｓｗｅｅｓｒｅｅｅｄｎｆｅｔ－ｔｎ．Ｔｈｅｕｌｈｗｅｈａｌ１Ａｓｔａｎｒｗｗｅｌｉｅｍｅｔｔｏｓｂｓｒｔｓｈｗｅｅ．ｄｆｅｅｔｓｒｉａｉｏｅｒｓｔｓｏｄｔｔａｌ７ｎｓｒｉｓｇｅｌｎ４ｆｒｎａｉｎｕｔａｅ，ｏｖｒｓｉｒｎｔａｎｈｄｄｆｅｅｔａｉｐｒｄｕｉｐａｌｔｉｔｅａｆｒｉｒｎｃｄｏｃｎｇｃａｂｉｉｙｎｈｓｍｅｅｍｅｎａｉｎｕｓｒｔｔｔｏｓｂｔａｅ．ＣｉｒｃｃｄｔｉａｉｐｒｄｃｉｇａｂｉｔｏｏｕｔｎｃｐａｌｙｆＦＧ１ｉ７，

L乳酸高产菌株的诱变选育

!选出十株
!选
#$%$1
表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象，称为表型延迟，为了克服表型延迟，必须将诱变处理的菌液进行中间培养，即将一定量的菌液接入完全液体培养基中培养过夜。玻璃管初筛平板的制作将直径为 #%** 的
! !选
!选出十株
每株三瓶 !复筛，
#$%$2
复筛。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精度）为主。初筛的要求是根据在平板上的直观反应挑选高产菌株。所谓平板上直观反应，是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示剂
%(
!""!#!
万$%&’("$%’%))%
$** $** (* 4/ /* 4* )E* )* -* #* !* $* * * ! 图$ 存活率（5）存活率
#$%$&
孢子配制成 #’( 个孢子 ) *+ 的悬浮液，取 #’*+ 置于培养皿中，用磁力搅拌器搅拌的过程中，用紫外灯照射 ,*-. ，照射距离 &’/*。将诱变菌液在琥珀酸平板、高锰酸钾 0 溴化钾平板、高葡萄糖平板、高乳酸平板、纯乳酸平板上涂布分离，挑选在琥珀酸平板上生长慢、菌落小的，耐高葡萄糖、高乳酸且不分解利用乳酸的产乳酸的菌珠进行斜面保藏。中间培养突变基因的出现并不意味着突变
纯乳酸平板・ $&$* ， =6":, >8#: 乳酸
・ $&$#+ ， ?@":, >8#: 葡萄糖
$&$,, ，
乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸，广泛存在于人体、动物体、植物和微生物中，乳酸按其旋（( ） —乳酸，（/ ） —乳酸和 -.—乳酸光性可分为 . 三种。人体只能代谢利用其中的 .—乳酸，因此，世界卫生组织提倡使用 .—乳酸作为食品添加剂和内服药，取代目前普遍使用的 -.—乳酸。此外， .—乳酸，农业和化 .—乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、学工业。尤其近几年，人们利用 .—乳酸聚合生成的聚 .—乳酸制造生物降解塑料、绿色包装材料及农用薄膜，用以解决日益严重的环境污染问题，引起了世界的广泛关注，应用前景非常广阔。以本课题采用 011.()2+ 米根霉为出发菌株，紫外线为诱变剂，经筛选得到一株高产乳酸且耐高渗并且不分解利用乳酸的正向突变菌株。

柠檬酸发酵微生物

• 3.真空冷冻干燥保藏法（广泛采用的方法）
• 简称冻干法； • 通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后 • 置于低温下，使微生物 • 处于休眠状态，而得以 • 长期保藏。 • 使孢子始终处于低温、 • 干燥、缺氧的条件下。 • （1~10年）
• 4.液氮超低温（-196 ℃ ）保藏法
• 以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。 • 适用于菌种的长期保存，-196 ℃远远低于微生物新陈代谢作用停止温度（-130 ℃ ），此时菌体代谢活动已停止。
2.黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征
• ①能耐高浓度柠檬酸（15%以上），而不利用和分解柠檬酸。 • ②耐高浓度葡萄糖（18-20%）；能产生和分泌大量的酸性α -淀粉酶和酸性糖化酶，糖化酶最适作用 pH在4.0~4.6，最适温度为60~65 ℃。
• ③能利用淀粉质、糖蜜、葡萄糖母液等原料发酵生产柠檬酸。
（二）柠檬酸生产菌的诱变育种
诱变育种：在人为地条件下,利用物理,化学等因素, 诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和微生物地新品种，进而设法从大量的变异群体中筛选出优良的突变株的过程。
• 诱变剂-能提高菌种突变率的物质。 • 物理诱变剂：UV、氮离子注入、x射线等（染色体水平上导致突变） • 化学诱变剂：（导致更细微的基因水平的突变） • 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、 DES硫酸二乙酯 • 亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU） • 亚硝酸（改变核酸结构和性质） • 叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、吖啶橙等。

柠檬酸1

要充足氧的供应，保证更多的NADH2通过侧性呼吸链将H2交
给O2生成CO2和H2O，使呼吸产生的ATP减少，解除ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径代谢流增大，丙酮酸和草酰乙酸生
成水平提高，柠檬酸产率提高。
G
G-6-P
(磷酸果糖激酶)
柠檬酸
I ,NH4 A
+
1.6－二磷酸果糖
丙酮酸

(丙酮酸羧化酶)
白、核酸和脂肪含量明显减少，而氨基酸和铵离子水
平升高（解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制），丙酮酸和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。
4、氧对柠檬酸积累的调节
黑曲霉中除具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链
。标准呼吸链氧化时产生ATP，反馈抑制PFK酶，侧系呼吸链不产生ATP。缺氧时，侧系呼吸链失活，导致柠檬酸产量急剧下降。因此，在柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定
4
2014-6-5
二、国人的节奏—后来居上
1968年：上海酵母厂以淀粉为原料深层发酵工业化产生柠檬酸；同时，适用于多种不同培养基质（淀粉、木薯、糖蜜等）的菌株不断的被选育出来； 1995年：开发了利用玉米渣发酵柠檬酸的新工艺；我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽丰原生化公司，柠檬酸生产能力达18万吨，居世界第一位，占世界柠檬酸生产额的17%。另外，山东柠檬酸生化有限公司的生产规模也是相当的大。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约100万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，近两年，出口量更是超过国内总产量的90%，出口依赖严重。出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过60%。2006年柠檬产量达到66万吨，出口60万吨；2007年，国内柠檬酸及柠檬酸产量76万吨，共出口70.83万吨，2006年和2007年两年国内柠檬酸出口超过总产量的90%，出口依赖严重。全球柠檬酸的年需求量约为130万吨左右，且以年5%-7%的速度递增。2007年，全球柠檬酸需求继续以3%的幅度增长。随着中国人民生活水平的提高，也带动了柠檬酸国内需求的大幅度增加。

耐高温耐高酸柠檬酸菌种驯化及筛选

耐高温耐高酸柠檬酸菌种驯化及筛选【摘要】：选取发酵良好的出发菌株，通过高温和高酸驯化及筛选，得到2株耐37℃高温、耐高酸30%、发酵性能优于原柠檬酸菌种Co827黑曲霉。

【关键词】：柠檬酸黑曲霉；耐高温高酸菌株；筛选【abstract 】: the fermentation of good start strains, through the high temperature and high acid domestication and screening, get two strains 37 ℃high temperature resistance, resistance to high acid 30% better performance than the original citric acid, fermentation Co827 aspergillus species.【keywords 】: citric acid aspergillus; High temperature resistant strains of the high acid; screening前言：柠檬酸是一种用途广泛对环境没有任何破坏作用的无色晶体，在食品和饮料工业中作为调味剂、保鲜剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂。

为了提高菌种在高酸环境下酶的活性，需要对菌种进行耐高酸驯化。

柠檬酸深层通风发酵工艺在夏季高温季节，要控温在30℃-33℃，需采取一系列降温措施，为减少降温带来的麻烦和费用，采用耐高温柠檬酸发酵是行之有效的措施之一。

以黑曲霉Co827为出发菌种，从37℃高温发酵液中分离菌种，经酸性驯化优筛得到2株耐高温高酸、产酸高、转化率高的优良菌株。

1材料与方法1.1材料1.1.1样品高温发酵液分离出的菌株1.1.2培养基富集驯化培养基：80BX-150BX麦芽汁100ml，pH值自然，0.1MPa灭菌25min-30min;分离培养基：50BX-80BX麦芽汁100ml，琼脂2g，30%柠檬酸，0.1MPa，灭菌25min-30min，制成平板备用；摇瓶培养基：按参考文献[2]方法配制。

柠檬酸高产菌株选育

柠檬酸高产菌株的选育引言柠檬酸是一种可口的酸味剂，广泛用于食品工业的饮料、糖果生产，同时也是医药、化工行业的重要原料。

柠檬酸采用发酵法生产，某些青霉、多种曲霉和酵母都具有柠檬酸生产能力，其中黑曲霉是一种重要的生产菌株[1,2]。

许多微生物工作者对柠檬酸生产菌种的选育做了大量工作，经此可以获得一些高产菌株。

我们用黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。

为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。

目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。

本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。

1材料与方法1.1 材料1.1.1菌种以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。

1.1.2培养基分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。

1.1.3 试剂及仪器3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。

1.2 方法1.2.1 菌株的分离纯化用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。

1.2.2 初筛用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。

取各个不同梯度的孢子悬液1 mL注人2％淀粉查氏培养基平板中涂布，28℃，培养3 d 后，向培养基中滴人I-KI试剂，测量菌落产生的透明圈大小并记录下数据。

21.2.3 复筛将初筛所得透明圈较大的菌株接入废弃苹果榨汁培养基中进行培养，待发酵一段时间后，通过检测发酵液中的总糖、还原糖和柠檬酸的产量的量进一步筛选高产柠檬酸的黑曲霉菌株。

一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法

一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法在工业生产中，柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。

而黑曲霉是目前最主要的柠檬酸生产微生物，因其高效、高产等优点而备受青睐。

然而，对于黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法，如何提高其产量一直是一个备受关注的问题。

本文将从深度和广度的角度，探讨一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。

一、原理解析在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，关键的生产环节是发酵过程。

而要提高柠檬酸的产量，需要从以下几个方面进行优化：发酵菌株的选取、培养基的配方、发酵条件的控制等。

1. 发酵菌株的选取在选择发酵菌株时，需要考虑其对柠檬酸产量的影响。

一般来说，通过筛选高产菌株，可以有效提高柠檬酸的产量。

选择某些高柠檬酸产量的黑曲霉菌株，能够在一定程度上提高发酵产酸量。

2. 培养基的配方培养基的配方是影响柠檬酸产量的重要因素之一。

通过优化培养基的氮源、碳源、矿物盐等成分比例，可以为黑曲霉提供更适宜的生长环境，从而增加柠檬酸的产量。

添加适量的葡萄糖、氨基酸等营养物质，可以刺激黑曲霉的生长，提高柠檬酸的产量。

3. 发酵条件的控制发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件的控制对柠檬酸产量也有着重要的影响。

合理的温度和pH值可以促进黑曲霉的生长和柠檬酸的产生，而充足的氧气供应则能提高发酵效率，进而增加柠檬酸的产量。

二、实践应用上述原理虽然看似简单，但在实际应用中却需要综合考虑各个因素，并进行合理的优化。

在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，可以通过以下方法来提高产量：1. 优化菌株选取首先需要对已有的黑曲霉菌株进行筛选，选择出高产柠檬酸的菌株。

这需要借助研究机构或者实验室的支持，通过采用分子生物学技术等手段进行筛选和改良。

2. 调整培养基配方针对不同菌株、不同生产条件，可以优化培养基的配方，以满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。

在生产实践中，可以根据具体情况进行调整，以获得最佳效果。

3. 控制发酵条件在实际生产过程中，通过精确控制发酵过程中的温度、pH值和氧气供应，可以更好地满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。

柠檬酸高产黑曲霉菌株选育与发酵新底物研究-2008

2008年1月重庆师范大学学报(自然科学版)Jan.2008第25卷第1期Journal of Chongqing Nor mal University(Natural Science Editi on)Vol.25No.1柠檬酸高产黑曲霉菌株选育与发酵新底物研究3赵　琴,李　红,魏婷婷,唐平华,韦　伟(重庆师范大学生命科学学院,重庆400047)摘　要:本研究利用A spergillus niger AS3.3928作为对照菌株以废弃苹果榨汁为底物,设计了四因素四水平的正交实验。

在pH6,温度31℃,甲醇含量2%,发酵时间4d的最适条件下,黑曲霉的发酵最好。

将土壤中分离培养获得的20株黑曲霉,选出菌株透明圈相对较大的A1、A2、A5、A11这4株。

在最适条件下,根据4株菌发酵废弃苹果榨汁生产柠檬酸的情况来进行复筛,得到菌株A2;进而对A2进行鉴定,初步确定所得菌株为黑曲霉。

在最适条件下,A2发酵废弃苹果榨汁其柠檬酸的产量为1.539mg/mL,经对A2进行T21紫外诱变,筛选得到A221。

结果表明A221菌株柠檬酸产量比其父本增加了36.6%,比对照菌株AS3.3928增加了38.53%。

关键词:黑曲霉;菌株;柠檬酸;发酵;诱变中图分类号:Q932331;TS201.3文献标识码:A 文章编号:167226693(2008)0120079204 柠檬酸是一种重要的有机酸,在食品、化工、医药、建筑、印染、皮革、洗涤等行业都有广泛的用途。

柠檬酸的工业生产通常采用黑曲霉进行的深层发酵法,原料以薯干和玉米为主[1]。

20世纪80年代后,随着工业的发展人们对含柠檬酸产品的需求增加,而黑曲霉菌株的产酸能力是制约柠檬酸生产能力的一个瓶颈。

因此筛选获得高产柠檬酸的黑曲霉菌株具有重大意义。

在原料方面,薯干和玉米的价格不断上涨,致使柠檬酸的生产成本提高,新的廉价原料成为迫切解决的需求。

2000年我国苹果的产量达到2043万t,废弃的大概有20%[2]。

产柠檬酸用黑曲霉的选育

产柠檬酸用黑曲霉的选育产柠檬酸用黑曲霉的选育摘要：利用已有菌种进行分离复壮、斜面培养、麸曲培养，然后发酵，检测产生柠檬酸的量，选择产酸能力较高的菌种，在选出菌种的基础上重复此步骤，挑选出产酸能力最大的菌种，通过实验结果，表明第二次选育的菌种的产酸能力比第一次选育出的种子能够提高75.88％。

关键词：黑曲霉薯粉柠檬酸菌种选育引言柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。

早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。

我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步形成了生产体系。

柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。

1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。

产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变(induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。

中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。

在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。

李文玲等也曾经用Co<sup>60</sup>～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。

欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。

本文研究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。

2-1柠檬酸发酵工艺-zy

将②中孢子悬浮液
A、置于γ射线下照射处理，照射后孢子悬浮液稀释，取0.1mL涂平板。
B、DES诱变处理，孢子悬浮液4.5mL，加入 2%DES0.5mL，于30℃振荡5min，再加入 75%Na2S2O310mL，解毒10min或稀释10倍后涂平板。
C、复合诱变，Co60 γ射线---高温处理---亚硝基胍处理等，低剂量多次复合处理。
柠檬酸在制药方面的应用
❖ 1、作为泡腾片：柠檬酸与NaCO3或NaHCO3水溶液反应，生成大量CO2（泡腾）和柠檬酸钠，可使药物中活性配料迅速溶解并增强味觉能力。
❖ 2、柠檬酸糖浆是发热病人的清凉饮料，具有清凉、解毒功效。
❖ 柠檬酸普遍用于营养口服液中，维持活性配料的稳定性，加强防腐剂效果。
❖ 柠檬酸钙盐在水中的溶解度较小；并且随温度升高进一步降低。
❖ 柠檬酸钙的溶解度也与酸度有关，pH 值降低时溶解度增大
❖ 如果温度升高至95～100℃， Ca3(C6H5O7)·4H2O的溶解度可进一步降低为 0.578g/L水。
❖ 将溶液加热至沸，使柠檬酸钙盐比较完全沉淀析出，而其它有机酸钙（葡萄糖酸钙、草酸钙）等物质溶解。
采用不同原料所用菌种不同
淀粉原料:
TD-01,初糖浓度20.8%，96h,产酸率20.24%，转化率97.28%.
薯干原料: 糖蜜原料:
上海工微所东酒2号 N-558 Co827 T419
初糖浓度18-19%，60-90h,产酸率20.24%，转化率97%.
川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工所），产酸14%，性能粗放，抗金属离子能力强，以甘蔗糖蜜不需要黄血盐预处理。
烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、DES硫酸二乙酯亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）亚硝酸（改变核酸结构和性质）叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、吖啶橙等

柠檬酸

生物诱变剂
噬菌体
(1)2-氨基嘌呤 (2-AP) (2)5-溴尿嘧啶 (5-BU) (3)8-氮鸟嘌呤
(1)硫酸二乙酯(DES) (2)甲基硫酸乙酯(EMS) (3)N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG) (4)亚硝基甲基脲(NMU) (5)亚硝基乙基脲(NEU) (6)亚硝酸(NA) (7)氮芥(NM) (8)乙烯亚胺(EI) (9)羟胺(HN)
2.合成代谢
总述：葡萄糖首先通过糖酵解(EMP)/磷酸戊糖途径(HMP)得到磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸，然后经过一个不完整的三羧酸循环(TCA)达到柠檬酸的积累。思考： EMP、HMP、TCA存在大多数真核生物细胞中，但是为什么黑曲霉能够大量积累柠檬酸呢？
2.1代谢途径

2.1柠檬酸积累的理想条件： 1. 提高磷酸果糖激酶的活性 2. 提高丙酮酸羧化酶的活性 3. 提高柠檬酸合成酶的活性 4. 抑制顺乌头酸酶的活性 5. 抑制异柠檬酸脱氢酶的活性 6. 抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性 7. 抑制异柠檬酸裂解酶的活性
单氟乙酸平板
变色圈/ 菌落直径大者
敏感者
再结合菌体形态，及多次初筛、复筛
优良新菌株
Co827菌种的选育
• Co827菌种室上海工业微生物研究所，从土壤中经酸性平板分离获得的野生黑曲霉628作为出发菌株，经硫酸二乙酯和60Coγ射线等复合诱变获得的一株高产柠檬酸菌株。1982年用于工业化大生产。它可直接利用薯干粉发酵，产酸达13%以上。平均转化率为95%以上。其诱变谱系如下：
干粉4.5
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(1)吖啶类物质 (2)ICR类化合物
• ICR是美国抗癌研究所合成的吖啶类氮芥衍生物。

柠檬酸产生菌

2（0.25%）
3（0.5%） 3 （0.5%） 1 （0.1%）
X2 , X2
X3 , X3 X4 , X4 X5 , X5 X6 , X6
1 （0.05%） 2 （0.25%）
X7 ,
3.根据正交表的培养基配方配制不同
的培养基 4.正交实验结果测定 5.发酵结束后，测定每组培养基的平均产酸量,并填入正交表中，以便分析使用。
因素水平表
因
素 7H2O 蔗糖 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4· （%）（%）（%）（%） A 水平 1 2 3 10 15 20 0.1 0.2 0.3 0.05 0.1 02 0.1 0.25 0.5 B C D
L9(34)的正交表
列
号实验号 A（蔗糖） 1因素 B（ NH4NO3 ） 2因素 C（ KH2PO4 ） 3因素 D（MgSO4） 4因素

（二）淀粉含量的测定
1、淀粉的水解： 2、空白对照的确定： 3、还原糖测定： 4、淀粉含量计算原料中淀粉含量 (%)= C（ V0—V）×500×0.9× 10-3 ×100／W· VS = 45 C（ V0—V）/ W· VS 式中： C、 V0和V的含意与前述还原糖测定中的计算相同； W－－称取原料样品重量 (g)； VS－－滴定时吸取样品体积 (ml)； 500——样品定容至500ml。
（2）计算各因素同一水平的平均值
如：

A3/3

a1 = A1/3
a2 = A2/3
a3 =
其它因素同样计算（3）计算极差R值，决定因素的主次顺序。R值是各因素同一水平的平均值中最大值减最小值之极差。如： A因素 Ra = a中最大—a中最小 B因素 Rb = b中最大—b中最小 C因素 Rc = c中最大—c中最小 D因素 Rd = d中最大—d中最小比较Ra、Rb、Rc、Rd的大小，确定并排列主、