他克莫司高产菌株的理性化选育
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１ ％的种 子量 ，接入 装 有６ ｍＬ 酵 培养 基 （０ ｍＬＵ ０ ０ 发 ５０ ．
角瓶 １ ８ 、２ ０／ ｎ 荡培养 ５ 。 ，２ ℃ ２ｒ 振 ｍｉ ｄ
斜 面 和 分 离 琼 脂 培 养 基 ：麦 芽 浸 出 汁２０ ．％，酵 母浸 出汁０５ ，葡 萄糖 １０ ．％ ．％，琼 脂 １ ％，ｐ ．（ ． ５ Ｈ７２灭
ｓ ．ＣＺ ３ １ 高 了约 ２ 。 ｐ Ｆ ０ １提 倍
关 键 词 ： 弗 氏链 霉 菌 类 群 Ｆ Ｚ ３ １ 他 克 莫 司 前 体 结 构类 似 物 ；理 性 化 选 育 ；营 养 学 研 究 Ｃ ０ １； 中 图分 类号 ：Ｒ ７ ． ９ ９５ 文 献标 识码 ：Ａ
Ｒ ａ ｉ ｎａ ｃ ｅ ｎ ｎｇ ｆ ｒｈ ｇ ｐｒ ｄ ｔｏ ａ ｒ ｌｍ ｕｓｐｒ ｄｕ ｉ ｔ ａ ｎ ｔｏ ｌ ｒ ｅ ｉ ｏ ｉ ｈ ｏ ｕｃ ｉ ｎ ｔ ｃ ｏｉ ｓ － ｏ ｃｎｇ ｓｒ ｉ
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酵筛 选 ，挑 选 高产菌 株 作为 诱变 的起 始菌 株 。
株 进 行 不 断 选 育 ， 同时 对 突 变 株 的 发 酵 培 养 基 进行
优化 ， 图荻得 商产 的菌株 。 １ 材 料 与方 法
１ 诱变处理并 以前体 结构类似物作为选择压进行 ． ６ 选 育
将 方 法 １５ ． 中挑 选 到 的 高产 耐 药 菌 的 斜 面 孢 ｒ
等优 点 。由于他 克莫 司在 临床上 的重 要性 ，人们 试 图 从 各 方面 去 获得 新 的 高产 菌 株【ｌ。传统 的育种 方法 ｏ ］
收 稿 日期 ：２ １－２２ ０ ０ １．３
基金项 目：国家 “ 十一五 ”重大专项２ ０ ｚ９ ０ ．０ ； 建省公益类科研院所基本科研专项项 目２ １Ｒ１ １一． ０ ９ｘ ３２０ ４ 福 ０ ０ ０ ０１ 作者简 介：郑 军荣，女，硕士，助理研究员，从事抗生素菌种选育和发酵条件研 究。Ｅ ｍａｌｚｊｌ ａ ｏ ．ｏ ｃ 。 － ｉ ｈｒ＠ｙ ｈ ｏｃｍ． ： ｎ ’ 讯作者：程元荣，男 ，研究员 ，博士生导师 ，主要从事微 生物 新药研 究。Ｅ ｍａｌｔ 通 — ｉｉ ： ｍ＠ｐ ｂ ． ．．ｌ ｕ ３ｆ 巧ｅ ｚ ｌ
培 养 物 洗 下，制 成 １ ７ ０／ ｍＬ的孢 子悬 液 ， 用 ｕＶ处理 先
４ｓ ５ ，然 后ＮＴ ｌ ／ 处 Ｌ ２ ｍｉ，用 缓冲 液终 止 反 Ｇ ｍｇｍＬ ￣ ０ ｎ
Ｉ１ 菌株 ． 他 克 莫 刖 产 生 菌— — 弗 氏链 霉 菌 类 群 Ｆ ０ １ ＣＺ ３ １ （ｔ ｐｏ ｙ ｅ ｐ Ｆ Ｚ ３ ， 南福 建 省微 生 物研 究所 Ｓｒ ｔｍ ｃｓｓ ． Ｃ ０ １ ｅ １ ｌ
摘要 ： 目的 理性化选育他克 莫司高产 菌株 。方法 应用化学和物 理诱 变剂对他克莫司产生菌进行菌种诱变，并利用特定
的选择 剂即莽草酸和哌 可酸及其相应 的结构类似 物作为选择压力筛选 突变株 。然后对特 定的正突变株进行他 克莫 司生物合成 的 营养 学研 究。结果与结论 获得一株高产突变株６ 一３７ Ｈ ２ ，它的他克莫司相对发酵 效价 比出发菌株弗 氏链霉菌类群Ｓｒ ｔｍ ｃｓ ｔｐ ｏ ｙ ｅ ｅ
ＨＰ Ｃ分 析 条 件 ： Ｌ １ Ａ ｖ 型 高 效 液 相 色 谱 Ｌ Ｃ一 ０ Ｔ ｐ
发 酵 培 养基 ：玉 米 淀 粉 ５０ ．％，干 酵 母粉 １Ｏ ．％，
米 浆 １０ ．％，Ｋ， Ｏ ・ Ｏ ０２ ＨＰ Ｈ， ．％，Ｃ Ｃ ００ ％， ３ ａ Ｏ， ，５ ｐ ６８灭菌 前） Ｈ ．（ 。
（ 比如 紫外 、ＮＴ ，使 用 某些 抗生 素进 行诱 变 或使 用 Ｇ） 耐 受 自身代谢 产物 的方法 等对 他 克莫 司产生菌 进行 不 断选 育 ， 已取 得 了相应 的效 果 ，但 在进 一步 重复这 些 方法 进行 选育 ，菌 种很容 易产 生 回复突变 。我们利用 他 克莫 司分子 结构 中 的某 些基 团 的结构特 征 ，对经物 理 、化学 诱变 剂处 理后 的存活 菌株 ，再行 筛选 耐受 与 这些 基 团的结 构类似 的化 合物 的菌株 。莽 草酸 和哌 可 酸是他 克 莫司 生物合 成 中的两个 重 要 的前 体物 ，它们
菌前） 。
种 子 培 养 摹 ： 甘 油 １２ ， 可溶 性 淀 粉 １１ ．％ ． ％， 葡 萄 糖 ０５ ，酵 母 粉 ０５ ，玉 米 浆 ０５ ．％ ．％ ．％，Ｃａ Ｏ， Ｃ
０１ ，ｐ ．（ ． ％ Ｈ ６５灭菌 前） 。
１ 他克莫司含量测定（ Ｐ Ｃ ． ８ Ｈ Ｌ 法） 样 品 制 备 ：取 发 酵 液 １ ｍＬ， １ ０ ０ ／ ｎ 心 Ｏ ０ ｒｍｉ 离 １ ｍｉ ，收 取上 清 液 。加 １５ ０ ｎ ．ｍＬ甲醇 于 菌 丝沉 渣 ，振 荡提 取 ３ ｍｉ，离 心 收集 上清 液 。菌 丝 沉渣 重 复上 述 ０ ｎ 提取 步骤 ，合 并 三次 上清 液 ，进行 测 定 。
中国抗 生素杂志２ １年 １ 月第３卷 第１ 期 ０】 ０ ＿ ６ ０
文 章 编 号 ： １０ －６ ９２ １）００ ４ —６ ０ １８ ８（０ １—７ ５０ １
他克莫 司高产菌株 的理性 化选育
郑军 荣 乐 占线 魏 元 刚 陈宇翔 郑 卫 程 元 荣
（ 福建 省微 生物研 究所，福建省新药（ 生物） 微 筛选 重点实验 室， 福州 ３ ０ ０ ） ５０ ７
Ｂｉ ｓ ｎ ｈｅ ｉ ｕ ｒｔｏ ｏ ｙ ｔ ｓｓｎ ｔｉｉ ｎ
他 克莫 司（ ｃｏｉ ｓ，Ｆ 一０） 由链霉 菌 产 生 ｔ，ｌ ａｒ ｍｕ Ｋ ５ ６是
的含氮 ２ 元 环 的大环 内酯 类强 效免 疫抑制 剂 ， 已作 为 ３ 器 官移 植 的抗 排斥 和 治疗 自身 免疫 性 疾 病 药 物 【 ｌ ＿ 。 它不仅 在预 防各 种器 官移 植所 出现 的排斥 反应 时 ，效 力强于 环孢 菌素 １～ ０ 倍 ，而毒 副作 用 比环 孢 素低 。 ０ １０ 它 还 具有低 死亡 率 、高移植 存活 率 、高移 植物成 功 率
ｓ ｌｃ ｉ ｎｐｒ ｓ ｕ ｅ ａ ｌ ａ ｔ ｄ ｉ ｇ ｎ ｒｔｏ ｃ ｏｌ ｅｅ ｔｏ ｅ ｓ ｒ ， ｓｗｅ ｌ ｓｂｙ ｓｕ ｙ ｎ ｕｔｉｉ ｎ ｏｆ ａ ｒ ｉ ｔ ｍｕｓｂｉ ｓ ｎｔ ｓｓｏ ｅ ｎｉｅｐｏｓｔｖ ｕ ａ ． ｓ ｔａｎｄ ｏ ｙ ｈｅ ｉ ｎ ａ ｄ ｆ ｔ ｉｉ ｅｍ ｔｎｔ Ｒｅ ｕｌ ｉ
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１ 发 酵 ． ７
用 １ ％灭 菌 甘 油 水 ５ 洗 斜 面 孢 子 ， 制 成 悬 ５ ｍＬ
烯一一 酸及 莽 草酸 。 １羧 哌 可酸 及 结构 类 似 物 ： ６羟 基 吡 啶一 ． ． ２ 羧酸 ，哌 啶 酸 ，异 哌啶 酸及 哌 可酸 。
１ 培 养基 ． ３
浮 液 ，取 ０ １ 悬 液 接 种 于 装 有 ８ ｍＬ 子 培 养 基 ．ｍＬ ０ 种 （ ０ ｍＬ￣ 角 瓶 ８ 、２ ０ ／ ｎ 荡培 养 ２ 。 以 ５０ ，２ ℃ ２ ｒｍｉ振 ｄ
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构类 似 物 作 为 选 择 压 力 ， 对 耐 受 这些 药 物 的 弗 氏链
霉菌 类 群Ｆ Ｚ ３ Ｓｒ ｔｍ ｃｓｓ ． Ｃ ０ １的突变 Ｃ ０ （ｔ ｐ ｏ ｙ ｅ ｐ Ｆ Ｚ ３ １ １ ｅ １１
定 剂量 前体 及其 结构类 似 物 的分离 琼脂 平板 上 ，
２ ℃ 培养 １ｄ 右 。对 分 离得 到 的存 活 菌株 ，进行 发 ８ ０左
提供 。
应 ，并 用 生 理 盐 水 进 行 系 列稀 释 ， 取稀 释 液 分 别涂 布 在 含 有 最 低 抑 菌 浓 度 的 前 体 结 构类 似 物 的分 离琼
脂 平板 上 ，２ ℃培 养 １ ｄ 右 。 ８ ０左
１２ 前体 物及 其结构 类似 物 ．
莽 草 酸 及 结 构 类 似 物 ： 环 己烷 羧 酸 ， １环 己 一
他 克 莫 司 高产 菌株 的理 性化 选 育 郑 军 荣 等
经 过 一 系列 的生 物 反应 形成 他 克莫 司［－］ １１。本 文 应用 １ ２
洗 ，制 成 孢 子 悬 液 ，稀释 后取 适 量 分别 涂 布 于 含
理性 化 筛 选方 法 ，通 过 Ｕ ｖ、ＮＴ Ｇ复合 诱变 的菌 株 并 以莽 草酸 和 哌 可 酸两 个前 体 以及 与它 们 相 对 应 的 结
角瓶 １ ８ 、２ ０／ ｎ 荡培养 ５ 。 ，２ ℃ ２ｒ 振 ｍｉ ｄ
斜 面 和 分 离 琼 脂 培 养 基 ：麦 芽 浸 出 汁２０ ．％，酵 母浸 出汁０５ ，葡 萄糖 １０ ．％ ．％，琼 脂 １ ％，ｐ ．（ ． ５ Ｈ７２灭
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关 键 词 ： 弗 氏链 霉 菌 类 群 Ｆ Ｚ ３ １ 他 克 莫 司 前 体 结 构类 似 物 ；理 性 化 选 育 ；营 养 学 研 究 Ｃ ０ １； 中 图分 类号 ：Ｒ ７ ． ９ ９５ 文 献标 识码 ：Ａ
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收 稿 日期 ：２ １－２２ ０ ０ １．３
基金项 目：国家 “ 十一五 ”重大专项２ ０ ｚ９ ０ ．０ ； 建省公益类科研院所基本科研专项项 目２ １Ｒ１ １一． ０ ９ｘ ３２０ ４ 福 ０ ０ ０ ０１ 作者简 介：郑 军荣，女，硕士，助理研究员，从事抗生素菌种选育和发酵条件研 究。Ｅ ｍａｌｚｊｌ ａ ｏ ．ｏ ｃ 。 － ｉ ｈｒ＠ｙ ｈ ｏｃｍ． ： ｎ ’ 讯作者：程元荣，男 ，研究员 ，博士生导师 ，主要从事微 生物 新药研 究。Ｅ ｍａｌｔ 通 — ｉｉ ： ｍ＠ｐ ｂ ． ．．ｌ ｕ ３ｆ 巧ｅ ｚ ｌ
培 养 物 洗 下，制 成 １ ７ ０／ ｍＬ的孢 子悬 液 ， 用 ｕＶ处理 先
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摘要 ： 目的 理性化选育他克 莫司高产 菌株 。方法 应用化学和物 理诱 变剂对他克莫司产生菌进行菌种诱变，并利用特定
的选择 剂即莽草酸和哌 可酸及其相应 的结构类似 物作为选择压力筛选 突变株 。然后对特 定的正突变株进行他 克莫 司生物合成 的 营养 学研 究。结果与结论 获得一株高产突变株６ 一３７ Ｈ ２ ，它的他克莫司相对发酵 效价 比出发菌株弗 氏链霉菌类群Ｓｒ ｔｍ ｃｓ ｔｐ ｏ ｙ ｅ ｅ
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（ 比如 紫外 、ＮＴ ，使 用 某些 抗生 素进 行诱 变 或使 用 Ｇ） 耐 受 自身代谢 产物 的方法 等对 他 克莫 司产生菌 进行 不 断选 育 ， 已取 得 了相应 的效 果 ，但 在进 一步 重复这 些 方法 进行 选育 ，菌 种很容 易产 生 回复突变 。我们利用 他 克莫 司分子 结构 中 的某 些基 团 的结构特 征 ，对经物 理 、化学 诱变 剂处 理后 的存活 菌株 ，再行 筛选 耐受 与 这些 基 团的结 构类似 的化 合物 的菌株 。莽 草酸 和哌 可 酸是他 克 莫司 生物合 成 中的两个 重 要 的前 体物 ，它们
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种 子 培 养 摹 ： 甘 油 １２ ， 可溶 性 淀 粉 １１ ．％ ． ％， 葡 萄 糖 ０５ ，酵 母 粉 ０５ ，玉 米 浆 ０５ ．％ ．％ ．％，Ｃａ Ｏ， Ｃ
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１ 他克莫司含量测定（ Ｐ Ｃ ． ８ Ｈ Ｌ 法） 样 品 制 备 ：取 发 酵 液 １ ｍＬ， １ ０ ０ ／ ｎ 心 Ｏ ０ ｒｍｉ 离 １ ｍｉ ，收 取上 清 液 。加 １５ ０ ｎ ．ｍＬ甲醇 于 菌 丝沉 渣 ，振 荡提 取 ３ ｍｉ，离 心 收集 上清 液 。菌 丝 沉渣 重 复上 述 ０ ｎ 提取 步骤 ，合 并 三次 上清 液 ，进行 测 定 。
中国抗 生素杂志２ １年 １ 月第３卷 第１ 期 ０】 ０ ＿ ６ ０
文 章 编 号 ： １０ －６ ９２ １）００ ４ —６ ０ １８ ８（０ １—７ ５０ １
他克莫 司高产菌株 的理性 化选育
郑军 荣 乐 占线 魏 元 刚 陈宇翔 郑 卫 程 元 荣
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他 克莫 司（ ｃｏｉ ｓ，Ｆ 一０） 由链霉 菌 产 生 ｔ，ｌ ａｒ ｍｕ Ｋ ５ ６是
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１ 发 酵 ． ７
用 １ ％灭 菌 甘 油 水 ５ 洗 斜 面 孢 子 ， 制 成 悬 ５ ｍＬ
烯一一 酸及 莽 草酸 。 １羧 哌 可酸 及 结构 类 似 物 ： ６羟 基 吡 啶一 ． ． ２ 羧酸 ，哌 啶 酸 ，异 哌啶 酸及 哌 可酸 。
１ 培 养基 ． ３
浮 液 ，取 ０ １ 悬 液 接 种 于 装 有 ８ ｍＬ 子 培 养 基 ．ｍＬ ０ 种 （ ０ ｍＬ￣ 角 瓶 ８ 、２ ０ ／ ｎ 荡培 养 ２ 。 以 ５０ ，２ ℃ ２ ｒｍｉ振 ｄ
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定 剂量 前体 及其 结构类 似 物 的分离 琼脂 平板 上 ，
２ ℃ 培养 １ｄ 右 。对 分 离得 到 的存 活 菌株 ，进行 发 ８ ０左
提供 。
应 ，并 用 生 理 盐 水 进 行 系 列稀 释 ， 取稀 释 液 分 别涂 布 在 含 有 最 低 抑 菌 浓 度 的 前 体 结 构类 似 物 的分 离琼
脂 平板 上 ，２ ℃培 养 １ ｄ 右 。 ８ ０左
１２ 前体 物及 其结构 类似 物 ．
莽 草 酸 及 结 构 类 似 物 ： 环 己烷 羧 酸 ， １环 己 一
他 克 莫 司 高产 菌株 的理 性化 选 育 郑 军 荣 等
经 过 一 系列 的生 物 反应 形成 他 克莫 司［－］ １１。本 文 应用 １ ２
洗 ，制 成 孢 子 悬 液 ，稀释 后取 适 量 分别 涂 布 于 含
理性 化 筛 选方 法 ，通 过 Ｕ ｖ、ＮＴ Ｇ复合 诱变 的菌 株 并 以莽 草酸 和 哌 可 酸两 个前 体 以及 与它 们 相 对 应 的 结