黄霉素高产菌株的选育
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(1. HLJ August First Reclamation University , Daqing 163319 ,China ;2. Tianjin Agricultural University ,Tianjin 300384 ,China)
Abstract :Objective : In order to get some high - yield strains , different mutant modes and screening factors were used. Method :A flavomycin
玉米粉 2g , K2 HPO4 0. 5g ,MgSO4 0. 5g ,NaCl 0. 5g ,定容 1L , pH 值
7. 2～7. 4 ; 发酵培养基 :豆饼粉 37. 5g ,玉米粉 15g ,葡萄糖 10g ,可溶
性淀粉 37. 5g , (NH4 ) 2 SO4 2. 5g ,MgSO4 0. 15g , CaCO3 3g , K2 HPO4
Key words :Flavomycin ;UV mutagenesis ; HNO2 mutagenesis
加纳链霉菌 SgWE - 11 是本实验室分离得到的一株抗生 素产生菌 ,黄霉素 ( Flavomycin) 是其主要次级代谢产物 。黄霉 素 (Flavomycin) 又称为斑伯霉素 BM (Bambermycins) 、黄磷脂醇 素 FV (Flavop Hospolipol) 、默诺霉素 A (Moenomycin A) ,商品名为 富乐霉素 ,是一种新型的抗生素类药物添加剂或促生长剂 ,至 少由 4 种微生物活性物质组成 ,即默诺霉素 A、B1 、B2 和 C ,其 中默诺霉素 A 为主要成分[1] ,黄霉素是由 Lindner 等人于 1955 年从灰绿链霉素菌 S . banbergiensis (斑伯氏链丝菌) 的发酵产物 中分离的磷酸多糖类抗生素[2] 。该抗生素是一种含磷的糖 酯[3 ,4] ,不同于现有的任何一种抗生素 。黄霉素对革兰氏阳性 菌抑菌效果显著 (如金黄色葡萄球菌 、链球菌和双球菌等) ,用 作饲料添加剂 ,具有很好的促生长作用 。但黄霉素在发酵生 产中产量太低 ,限制了对它的研究和应用 。目前 ,国际上有关 黄霉素的发酵及化学合成的研究报道主要来自德国 [5] ,国内 市场上销售的产品也是由德国生产 (商品名富乐旺 ,10 %含 量 ,100 元Πkg 左右) 。国内有关黄霉素的报道多是在动物养殖 方面的 ,很少涉及菌种及发酵工艺 ,并且黄霉素效价值距离生 产要求还有一定距离 ,因此在这方面的研究工作很有意义 。
2 结果与分析
2. 1 紫外线诱变剂量的考察 以 SgWE - 11 为出发菌株 ,取制备好的单孢子悬液 10mL
置于一平皿内 ,将装有孢子悬液的平板置于波长 237. 5nm、功
28 生 物 技 术 第 16 卷第 6 期
2006 年 12 月 黄霉素高产菌株的选育 27
关键词 :黄霉素 ;紫外线诱变 ;亚硝酸诱变 中图分类号 :TQ93 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 311X(2006) 06 - 0026 - 04
Improvement of Flavomycin Production in Streptomyces
ghanaesis WE - 11 by Combination Mutant
WANG Hong - xiu1 , GAO Shu - ren1 ,TONG Ying - kai2 3 , YANG Yong - tao2 ,WEI Dong - sheng2
0. 08g ,定容 1L ,pH 值 7. 2～7. 4 。 1. 1. 5 培养条件
斜面培养条件 :培养温度 37 ℃,相对湿度 30 %～60 % ,培 养时间 7d。
种子培养条件 :培养温度 37 ℃,装量 25mLΠ250mL 三角瓶 , 摇床转速 200rΠmin ,培养时间 2d。
发酵瓶培养条件 :培养温度 37 ℃,装量 25mLΠ250mL 三角 瓶 ,摇床转速 200rΠmin ,接种量 5 % ,培养时间 7d。 1. 2 方法 1. 2. 1 菌株诱变 1. 2. 1. 1 孢子悬液的制备[6] :将培养 7d 的孢子斜面加入适量 的无菌水 ,刮下孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶中 ,在回转式摇 床上震荡 30min ,然后用 9 层纱布过滤 ,诱变处理时孢子浓度 稀释至 106 个ΠmL 。 1. 2. 1. 2 紫外线诱变 :单孢子悬液涂布平板后 ,15W 紫外灯 30cm 照射一定时间后 ,避光培养至菌落长出 。 1. 2. 1. 3 亚硝酸诱变 :孢子悬液 1mL 加入 1molΠL pH4. 5 的醋 酸缓冲液 2mL 后摇匀 ,加 0. 2molΠL 亚硝酸钠溶液 1mL (诱变 剂) 混合均匀 ,使亚硝酸的处理浓度为 0. 05molΠL ,25～26 ℃保 温诱变不同时间 ,时间到后加 0. 07molΠL pH8. 6 NaH2 PO4 溶液
第 16 卷第 6 期 2006 年 12 月
:26
生 物 技 术 BIOTECHNOLOGY
Vol116
,No16 :26 Dec12006
2. 上海英骏生物公司测序报告 : 整合载体 pb - Trs - n 测序结果 :以 Tkt - up 单引物测序的部分 DNA 片段 。
株 ,不同时间下进行亚硝酸诱变 ,根据菌体存活率和死亡率绘 制的菌体对亚硝酸诱变得致死曲线 (图 2) ,可以看出 SgWEU 9 对亚硝酸抗性很强 ,在 120min 时死亡率接近 100 % ,故在选 择较高剂量的同时 ,为保证能获得足够的突变株进行进一步 的筛选 ,选用 100min 作为诱变时间比较合适 。
率 15W 紫外灯下 30cm 处开盖 ,震荡照射 0 、10s、20s、30s、40s、 50s、60s、70s、80s、90s、100s ,根据紫外线诱变的致死曲线 (图 1) 可以看出在照射 70s 时 ,致死率已达 100 %。
2. 3 亚硝酸诱变剂量的考察 以 2. 2 节筛选得到的 SgWEU - 9 作为这轮诱变的出发菌
灭菌锅 (上海申安医疗器械厂) 。
1. 1. 4 培养基 斜面和平板培养基 : 高氏一号培养基 (可溶性淀粉 20g ,
KNO3 1g , MgSO4 ·7H2O 0. 5g , NaCl 0. 5g , K2 HPO4 0. 5g , FeSO4
0. 01g ,琼脂 20g ,定容 1L ,pH 值 7. 4) ; 液体种子培养基 :可溶性淀粉 30g ,葡萄糖 10g ,蛋白胨 4g ,
HYG- Ⅱ回转式恒温调速摇柜 (上海欣蕊自动化设备有 限公司) ;PHZ40A 型恒温培养箱 (上海 - 恒科学仪器有限公 司) ;XW - 80A 漩涡混合器 (江苏省海门市其林贝尔仪器制造 有限公司) ;LXJ - ⅡB 型离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;SH - 4 磁力搅拌器 (北京金紫光仪器仪表公司) ; ZDX - 35B1 型高压
收稿日期 :2006 - 06 - 09 ;修回日期 :2006 - 09 - 07 基金项目 :天津市高等学校科技发展基金项目资助 (020804) 作者简介 :王洪秀 (1981 - ) ,女 ,在读硕士生 , E - mail :wanghongxiu0624 @163. com ; 3 通讯作者 :童应凯 (1961 - ) ,男 ,副教授 ,研究方向 :微生 物遗传育种 ,E - mail :yingkaitong @126. com ,Tel :022 - 89485412 。
producing strain SgWE - 11 was treated by UV and flavomycin as screening factor. Results :A stable strain was obtained with the titer of flavomycin
increased by 170. 25 % than parent strain. Then the mutant which grow on media containing Streptomycin was treated with HNO2 ,we got a high yeild strain SgWE - 25. The productivity of strain SgWE - 25 reached 875uΠmL which was 4. 4 - times. higher than that of the original of strain Sg2 WE - 11. When it was subcultured combined with natural screening ,its stability was rather satisfied.
(终止液) 2mL 以终止反应 。 1. 2. 1. 4 诱变筛选[7] :出发菌株的单孢子悬液诱变处理后 ,经 过初筛和复筛 ,选取产量最高的 3 株菌转接斜面 ,待长至孢子 丰满后 ,收集孢子制成悬液 ,进行下一轮诱变 。不断重复以上 操作 ,直至得到理想菌株 。 1. 2. 2 筛选方法 1. 2. 2. 1 初筛 :琼脂块移菌法 ,菌落在分离培养基上长出后用 牙签挑至 F = 6mm 的固体发酵培养基琼脂柱上 ,37 ℃培养 7d 后移至以金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 26003 为指示 菌的双层平板上 ,培养 24h 后测量抑菌圈的直径作为指标 。 1.2. 2. 2 复 筛 : 发 酵 后 , 将 50mL 发 酵 液 离 心 (3 000rΠmin , 20min) 得上清液 ,取上清液以双碟扩散法测定发酵液效价 ,指 示菌为金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 26003 。
黄霉素高产菌株的选育
王洪秀1 ,高树仁1 ,童应凯2 3 ,杨永涛2 ,韦东胜2
(1. 黑龙江八一农垦大学 ,黑龙江 大庆 163319 ;2. 天津农学院 ,天津 300384) 摘要 :目的 :为了获得黄霉素高产菌株 。方法 :进行了一系列的诱变筛选 。以加纳链霉菌 ( Streptomyces ghanaesis) SgWE - 11 为 出发菌株 ,采用紫外线诱变 ,以其自身代谢物黄霉素作为筛选因子 。结果 :获得一株遗传稳定且黄霉素发酵效价比出发菌株高出 170. 25 %的菌株 。对该菌株采用亚硝酸诱变 ,并以链霉素作为筛选因子时得到一株效价值为 875uΠmL 的高产菌株 SgWE - 25 ,比 出发菌株 SgWE - 11 提高了 4. 4 倍 。传代结果表明 ,在传代的同时结合自然分离 ,可以保持稳定的产抗特性 。
本文采用复合诱变 ,通过 3 轮诱变就得到 1 株黄霉素高产 菌株 ,其摇瓶效价较出发菌株提高了 4. 4 倍 。该菌株的稳定 性试验表明 ,在传代的同时结合自然分离 ,可以保持稳定的产 抗性能 。
1 材料及方法
1. 1 材料 1. 1. 1 实验材料
加纳链霉菌 SgWE - 11 和指示ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ金黄色葡萄球菌 (26003) 由本实验室保藏 。 1. 1. 2 试剂
无水乙醇 ,天津市北方化玻购销中心 ; 链霉素 ,华北制药 股份有限公司 ;黄霉素 ,德国赫斯特公司 ; 琼脂粉 、蛋白胨 ,天 津市英博生化试剂有限公司 ;可溶性淀粉 ,天津市北方天医化 学试剂厂 ;玉米粉 、豆饼粉 ,吉林省黄龙食品工业有限公司 ;亚 硝酸钠 ,上海试剂一厂 ;葡萄糖 、硫酸亚铁 ,天津市化学试剂三 厂 ;硫酸铵 、磷酸氢二钾 、硝酸钾 、氯化钠 、硫酸镁 ,天津市津东 天正精细化学试剂厂 ;碳酸钙 ,北京红星化工厂 。 1. 1. 3 仪器
Abstract :Objective : In order to get some high - yield strains , different mutant modes and screening factors were used. Method :A flavomycin
玉米粉 2g , K2 HPO4 0. 5g ,MgSO4 0. 5g ,NaCl 0. 5g ,定容 1L , pH 值
7. 2～7. 4 ; 发酵培养基 :豆饼粉 37. 5g ,玉米粉 15g ,葡萄糖 10g ,可溶
性淀粉 37. 5g , (NH4 ) 2 SO4 2. 5g ,MgSO4 0. 15g , CaCO3 3g , K2 HPO4
Key words :Flavomycin ;UV mutagenesis ; HNO2 mutagenesis
加纳链霉菌 SgWE - 11 是本实验室分离得到的一株抗生 素产生菌 ,黄霉素 ( Flavomycin) 是其主要次级代谢产物 。黄霉 素 (Flavomycin) 又称为斑伯霉素 BM (Bambermycins) 、黄磷脂醇 素 FV (Flavop Hospolipol) 、默诺霉素 A (Moenomycin A) ,商品名为 富乐霉素 ,是一种新型的抗生素类药物添加剂或促生长剂 ,至 少由 4 种微生物活性物质组成 ,即默诺霉素 A、B1 、B2 和 C ,其 中默诺霉素 A 为主要成分[1] ,黄霉素是由 Lindner 等人于 1955 年从灰绿链霉素菌 S . banbergiensis (斑伯氏链丝菌) 的发酵产物 中分离的磷酸多糖类抗生素[2] 。该抗生素是一种含磷的糖 酯[3 ,4] ,不同于现有的任何一种抗生素 。黄霉素对革兰氏阳性 菌抑菌效果显著 (如金黄色葡萄球菌 、链球菌和双球菌等) ,用 作饲料添加剂 ,具有很好的促生长作用 。但黄霉素在发酵生 产中产量太低 ,限制了对它的研究和应用 。目前 ,国际上有关 黄霉素的发酵及化学合成的研究报道主要来自德国 [5] ,国内 市场上销售的产品也是由德国生产 (商品名富乐旺 ,10 %含 量 ,100 元Πkg 左右) 。国内有关黄霉素的报道多是在动物养殖 方面的 ,很少涉及菌种及发酵工艺 ,并且黄霉素效价值距离生 产要求还有一定距离 ,因此在这方面的研究工作很有意义 。
2 结果与分析
2. 1 紫外线诱变剂量的考察 以 SgWE - 11 为出发菌株 ,取制备好的单孢子悬液 10mL
置于一平皿内 ,将装有孢子悬液的平板置于波长 237. 5nm、功
28 生 物 技 术 第 16 卷第 6 期
2006 年 12 月 黄霉素高产菌株的选育 27
关键词 :黄霉素 ;紫外线诱变 ;亚硝酸诱变 中图分类号 :TQ93 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 311X(2006) 06 - 0026 - 04
Improvement of Flavomycin Production in Streptomyces
ghanaesis WE - 11 by Combination Mutant
WANG Hong - xiu1 , GAO Shu - ren1 ,TONG Ying - kai2 3 , YANG Yong - tao2 ,WEI Dong - sheng2
0. 08g ,定容 1L ,pH 值 7. 2～7. 4 。 1. 1. 5 培养条件
斜面培养条件 :培养温度 37 ℃,相对湿度 30 %～60 % ,培 养时间 7d。
种子培养条件 :培养温度 37 ℃,装量 25mLΠ250mL 三角瓶 , 摇床转速 200rΠmin ,培养时间 2d。
发酵瓶培养条件 :培养温度 37 ℃,装量 25mLΠ250mL 三角 瓶 ,摇床转速 200rΠmin ,接种量 5 % ,培养时间 7d。 1. 2 方法 1. 2. 1 菌株诱变 1. 2. 1. 1 孢子悬液的制备[6] :将培养 7d 的孢子斜面加入适量 的无菌水 ,刮下孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶中 ,在回转式摇 床上震荡 30min ,然后用 9 层纱布过滤 ,诱变处理时孢子浓度 稀释至 106 个ΠmL 。 1. 2. 1. 2 紫外线诱变 :单孢子悬液涂布平板后 ,15W 紫外灯 30cm 照射一定时间后 ,避光培养至菌落长出 。 1. 2. 1. 3 亚硝酸诱变 :孢子悬液 1mL 加入 1molΠL pH4. 5 的醋 酸缓冲液 2mL 后摇匀 ,加 0. 2molΠL 亚硝酸钠溶液 1mL (诱变 剂) 混合均匀 ,使亚硝酸的处理浓度为 0. 05molΠL ,25～26 ℃保 温诱变不同时间 ,时间到后加 0. 07molΠL pH8. 6 NaH2 PO4 溶液
第 16 卷第 6 期 2006 年 12 月
:26
生 物 技 术 BIOTECHNOLOGY
Vol116
,No16 :26 Dec12006
2. 上海英骏生物公司测序报告 : 整合载体 pb - Trs - n 测序结果 :以 Tkt - up 单引物测序的部分 DNA 片段 。
株 ,不同时间下进行亚硝酸诱变 ,根据菌体存活率和死亡率绘 制的菌体对亚硝酸诱变得致死曲线 (图 2) ,可以看出 SgWEU 9 对亚硝酸抗性很强 ,在 120min 时死亡率接近 100 % ,故在选 择较高剂量的同时 ,为保证能获得足够的突变株进行进一步 的筛选 ,选用 100min 作为诱变时间比较合适 。
率 15W 紫外灯下 30cm 处开盖 ,震荡照射 0 、10s、20s、30s、40s、 50s、60s、70s、80s、90s、100s ,根据紫外线诱变的致死曲线 (图 1) 可以看出在照射 70s 时 ,致死率已达 100 %。
2. 3 亚硝酸诱变剂量的考察 以 2. 2 节筛选得到的 SgWEU - 9 作为这轮诱变的出发菌
灭菌锅 (上海申安医疗器械厂) 。
1. 1. 4 培养基 斜面和平板培养基 : 高氏一号培养基 (可溶性淀粉 20g ,
KNO3 1g , MgSO4 ·7H2O 0. 5g , NaCl 0. 5g , K2 HPO4 0. 5g , FeSO4
0. 01g ,琼脂 20g ,定容 1L ,pH 值 7. 4) ; 液体种子培养基 :可溶性淀粉 30g ,葡萄糖 10g ,蛋白胨 4g ,
HYG- Ⅱ回转式恒温调速摇柜 (上海欣蕊自动化设备有 限公司) ;PHZ40A 型恒温培养箱 (上海 - 恒科学仪器有限公 司) ;XW - 80A 漩涡混合器 (江苏省海门市其林贝尔仪器制造 有限公司) ;LXJ - ⅡB 型离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;SH - 4 磁力搅拌器 (北京金紫光仪器仪表公司) ; ZDX - 35B1 型高压
收稿日期 :2006 - 06 - 09 ;修回日期 :2006 - 09 - 07 基金项目 :天津市高等学校科技发展基金项目资助 (020804) 作者简介 :王洪秀 (1981 - ) ,女 ,在读硕士生 , E - mail :wanghongxiu0624 @163. com ; 3 通讯作者 :童应凯 (1961 - ) ,男 ,副教授 ,研究方向 :微生 物遗传育种 ,E - mail :yingkaitong @126. com ,Tel :022 - 89485412 。
producing strain SgWE - 11 was treated by UV and flavomycin as screening factor. Results :A stable strain was obtained with the titer of flavomycin
increased by 170. 25 % than parent strain. Then the mutant which grow on media containing Streptomycin was treated with HNO2 ,we got a high yeild strain SgWE - 25. The productivity of strain SgWE - 25 reached 875uΠmL which was 4. 4 - times. higher than that of the original of strain Sg2 WE - 11. When it was subcultured combined with natural screening ,its stability was rather satisfied.
(终止液) 2mL 以终止反应 。 1. 2. 1. 4 诱变筛选[7] :出发菌株的单孢子悬液诱变处理后 ,经 过初筛和复筛 ,选取产量最高的 3 株菌转接斜面 ,待长至孢子 丰满后 ,收集孢子制成悬液 ,进行下一轮诱变 。不断重复以上 操作 ,直至得到理想菌株 。 1. 2. 2 筛选方法 1. 2. 2. 1 初筛 :琼脂块移菌法 ,菌落在分离培养基上长出后用 牙签挑至 F = 6mm 的固体发酵培养基琼脂柱上 ,37 ℃培养 7d 后移至以金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 26003 为指示 菌的双层平板上 ,培养 24h 后测量抑菌圈的直径作为指标 。 1.2. 2. 2 复 筛 : 发 酵 后 , 将 50mL 发 酵 液 离 心 (3 000rΠmin , 20min) 得上清液 ,取上清液以双碟扩散法测定发酵液效价 ,指 示菌为金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 26003 。
黄霉素高产菌株的选育
王洪秀1 ,高树仁1 ,童应凯2 3 ,杨永涛2 ,韦东胜2
(1. 黑龙江八一农垦大学 ,黑龙江 大庆 163319 ;2. 天津农学院 ,天津 300384) 摘要 :目的 :为了获得黄霉素高产菌株 。方法 :进行了一系列的诱变筛选 。以加纳链霉菌 ( Streptomyces ghanaesis) SgWE - 11 为 出发菌株 ,采用紫外线诱变 ,以其自身代谢物黄霉素作为筛选因子 。结果 :获得一株遗传稳定且黄霉素发酵效价比出发菌株高出 170. 25 %的菌株 。对该菌株采用亚硝酸诱变 ,并以链霉素作为筛选因子时得到一株效价值为 875uΠmL 的高产菌株 SgWE - 25 ,比 出发菌株 SgWE - 11 提高了 4. 4 倍 。传代结果表明 ,在传代的同时结合自然分离 ,可以保持稳定的产抗特性 。
本文采用复合诱变 ,通过 3 轮诱变就得到 1 株黄霉素高产 菌株 ,其摇瓶效价较出发菌株提高了 4. 4 倍 。该菌株的稳定 性试验表明 ,在传代的同时结合自然分离 ,可以保持稳定的产 抗性能 。
1 材料及方法
1. 1 材料 1. 1. 1 实验材料
加纳链霉菌 SgWE - 11 和指示ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ金黄色葡萄球菌 (26003) 由本实验室保藏 。 1. 1. 2 试剂
无水乙醇 ,天津市北方化玻购销中心 ; 链霉素 ,华北制药 股份有限公司 ;黄霉素 ,德国赫斯特公司 ; 琼脂粉 、蛋白胨 ,天 津市英博生化试剂有限公司 ;可溶性淀粉 ,天津市北方天医化 学试剂厂 ;玉米粉 、豆饼粉 ,吉林省黄龙食品工业有限公司 ;亚 硝酸钠 ,上海试剂一厂 ;葡萄糖 、硫酸亚铁 ,天津市化学试剂三 厂 ;硫酸铵 、磷酸氢二钾 、硝酸钾 、氯化钠 、硫酸镁 ,天津市津东 天正精细化学试剂厂 ;碳酸钙 ,北京红星化工厂 。 1. 1. 3 仪器