微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验

实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏

一、实验目的和要求

1.了解微生物的分离纯化方法。

2.学习检测水中大肠菌群的方法。

3.学习微生物的保藏及鉴定方法。

4.熟悉革兰氏染

二、实验原理

多管发酵法

多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。

1.初发酵试验

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。

2.平板分离

初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。

3.复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、实验器材及试剂

1.水样

污水样本

2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。

3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等

四、实验方法及步骤

1.第一天

实验前的准备

1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温

高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。

2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。

3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。于121℃高温高压灭菌20分钟。

4）称取1.8克氯化钠，溶于200mL水中，于121℃高温高压灭菌20分钟。

2.第二天

1）将3支试管根据取样地的不同贴好标签，写好姓名学号，在取样处现场在每支试管中滴加3-4滴水样，37℃培养24小时。

3.第三天

1）取出培养过的水样，取产气最多的一支备用。

2）从试管中取1mL加入到9mL无菌水中，再依次稀释100、1000直至100000倍。

3）将5个梯度的稀释样以划线分离法和平板涂布法接在培养基的表面，于37℃培养24小时。

4.第四天

挑取颜色较深的菌落

1）制片：取一块干净的载玻片，各靠一小滴无菌水，以无菌操作规程分别挑取大肠杆菌和枯草杆菌少量，涂布于对应的载玻片上与无菌水混匀，涂成极薄的菌膜。自然干燥后再通过酒精灯进行热固定。

2）初染：于菌膜上滴加结晶紫染液，以盖满菌膜为宜，染色1-2 min后倾去染液，用蒸馏水轻轻冲洗至流下无色为止，甩去载玻片上的残余水。

3）媒染：滴加碘液染色1-2min，用蒸馏水冲洗干净。

4）脱色：滴加95%酒精液脱色30秒钟（准确计时），用蒸馏水冲洗干净。

5）复染：滴加蕃红液染色1-2min，用蒸馏水冲洗干净最后自然干燥。

6）镜检

7）将生长良好的菌落接种在斜面培养基上，37℃培养24小时。

5.第五天

微生物的保藏

（一）斜面低温保藏法：

此法为最常用的一种。一般霉菌；放线菌和有芽孢的细菌可保存2～4个月，酵母菌可保存2个月，无芽孢的细菌最好每周移接一次。操作过程如下：1）接种：将要保藏的菌种接入斜面培养基上，试管上贴好标签，写上菌种名称，时间。

2）培养：各类菌按其所需温度和时间进行培养。

3）保藏：选取生长健壮的菌种，于其试管带棉塞的上半部用灭菌的牛皮纸包扎好，以防棉塞受潮感染杂菌。置于4℃冰箱中保藏。

（二）液体石腊保藏法：

此法可用不分解石腊的菌种保藏。保存时间是半年至一年。放线菌；霉菌和产芽孢菌可保藏二年。液体石腊可防止培养基水分的蒸发，而引起的菌种死亡。同时可阻止氧气进入，防止好氧菌的生长。从而延长菌种保藏的时间。但需注意的是试管必须直立放置，并且不便携带。操作过程如下：

1）液体石腊的灭菌：将液体石腊装入锥形瓶中，量不超出锥形瓶体积的1/3，

塞上棉塞，包扎好后，进行高压蒸汽灭菌二次（120℃30分钟）。再在110～120℃干燥箱中蒸发掉蒸汽灭菌时带入的水分。此时石腊透明清亮状。经检验确定无菌后备用。

2）菌种培养：将所需的菌种经培养后，选取健状的保藏。

3）加石腊油：用无菌管吸取石腊油加入菌种试管中，以高出菌种斜面顶点1cm为宜。少了会因培养基露出油面，而使培养基变干造成菌死亡。

4）收藏：试管上部用牛皮纸包扎好，垂直立于冰箱中4℃。

5）恢复使用：当要使用菌种时。倾出石腊油。此石腊油可再灭菌重复使用。接种培养。由于菌体外粘有油。第一次的菌生长缓慢，性状恢复不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌种。

五、实验结果记录及计算：

1）乳糖胆盐培养基产气结果记录：

2）伊红美蓝琼脂培养基培养结果记录：

3）镜检结果记录：

六、实验结果分析及问题讨论：