病毒载量检测方法及其意义

工效率
6.5小时48份标本
48小时192份标本
二、病毒载量检测的意义


早期诊断 婴儿的早期诊断：感染HIV的母亲所生婴儿小 于18个月时，不能按照常规检测程序进行抗体检测 来确证是否感染了HIV。这种情况下，采集婴儿不 同时间的样本进行HIV核酸检测。 也可使用集合法对采供血机构的原料血浆及 HIV抗体阴性的高危人群样品进行核酸检测，及时 发现窗口期感染者，降低“残余危险度”，预防传 播。

指导抗病毒治疗及疗效判定
通常在病毒载量达到一定水平后（如>3500050000拷贝/毫升）抗病毒治疗才显示良好的 治疗效果。治疗后通过病毒水平的检测能够 确定治疗是否有效。理想的结果是治疗24周 后，病毒水平会控制在检测线以下。
.耐药性监测
可用于HIV耐药性检测和监测。治疗后病毒载 量得不到有效控制时被认为治疗失败。引起 治疗失败的原因之一是病毒对治疗药物的敏 感性降低或不敏感，也就是产生了耐药。对 病毒载量>1000拷贝/毫升的样本进行耐药性 检测对临床医生修改治疗方案有一定的帮助。
Roche
Simens(Bayer)
RT-PCR bDNA 产物为DNA，易发生污染，不对目标进行扩增，只进 对实验室区域划分严格 行信号放大
检测
辣根过氧化物酶标记检测 探针，TMB底物显色 用样品OD值和定标物OD 值的比值计算结果，需要 稀释扩增产物，检测范围 小，并且受酶活性、底物 氧化显色的影响 每次检测12或24个标本 需要设一个阴性、一个弱 阳性和一个强阳性对照 48人份/盒 每次试验12人份分装 一旦打开试剂盒，需要在 1个月内使用完48人份， 否则试剂失效 8小时24份标本
标记的探针与该复合体杂交结合。与化学发光底物共同孵育，所产生的光强度与
样品中HIV-1RNA的量成正比，以相对光强度单位（RLUs）表示的光度值被分 析系统记录下来，试剂盒中含有已知浓度的经β-丙内酯（BPL）处理的HIV18E5/LAV病毒液作为标准品，根据标准品的光吸收值绘制标准曲线，样品中
HIV-1 RNA的量可对照标准曲线求得。
三种病毒载量检测技术比较
厂家 商品名 扩增和检测原理 bioMerieux Nuclisens Easy Q 扩增：NASBA 检测：Real Time. Molecular Beacon 实时扩增检测 50-3,000,000IU/ml(v1.1) 线性范围广，无需稀释标本重复检测， 报告国际单位，易于统一标准 25-10,000,000IU/ml(v2.0) Roche COBAS Amplicor HIV-1 Monitor 1.5 扩增：RT-PCR 检测：底物显色 先扩增再检测 普通方法：400-750,000 Copies/ml 超敏方法：50-75,000 Copies/ml 线性范围有限，高浓度 样本需稀释检测，超敏 方法需要用低温超速离 心机离心1个小时 异丙醇沉淀 •异硫氰酸胍裂解，沉淀 物不可见，易引起操作 误差，异丙醇化学毒性 •标本只使用EDTA抗凝 血浆 Simens(Bayer) Versant 3.0 无需扩增：bDNA分枝 信号放大系统 检测：化学发光 先杂交，再检测 50-500,000Copies/ml
各级探针与被检物核酸杂 交，检测发光信号强弱 杂交孵育时间长，需要16 个小时
标本数量
每次检测8的整数倍标本 直至48个 不需要阴阳性对照 48人份/盒 每次试验8人份分装 独立包装，长期稳定
每次检测12的整数倍标本 需设一个阴性、一个弱阳 性和一个强阳性对照 192人份/盒 每次试验12人份分装
试剂盒包装
标准试验：能够定量400-750000拷贝/毫升的
HIV RNA，需要0.2毫升血浆。
超敏试验：能够定量50-75000拷贝/毫升的
HIV RNA,需要0.5毫升血浆。

NucliSens EasyQ HIV-1实验 是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选 择性地直接扩增RNA而没有PCR步骤，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱 氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取 高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录双链DNA中间体得到扩增。在AMVRT的作用下，HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被 RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成，反义RNA通过T7多聚酶启动 双链DNA合成，这个循环不断重复，使得靶RNA在等温条件下大量扩增100万到 1000万倍，然后直接用化学发光法确定核酸量，通过HIV特异的gag和pol区的3 个内标同时扩增而达到定量目的。它具有高度敏感性和广阔的动态范围。 最近
四、病毒载量测定结果的分析和解释
分析一个病人不同时间病毒载量测定的结果时，首先要考虑
测定结果的变化是真实的生物学改变还是方法本身的变异或 误差。 病毒载量的变化超过0.5log（大约是3倍）就超过了实验和每 日的正常变化，应被视为有生物学意义的变化，而0.5log以 内的变化就很难与随机的变异相区分。特别需要注意的是在 接近检测下限的时候，实验的变异对于解释病毒载量变化的 意义有更大的影响。例如，病毒载量从50cp/ml增加到 150cp/ml，虽然变化的幅度达到0.5log，但真正反映的可能 是实验的变异而不是抗病毒治疗的失败，因此对于接近检测 下限的测定结果需要进行认真分析。
三、影响病毒载量测定结果的因素

样本类型： 血浆和血清标本都可用来测定病毒载量， 但是血清的检测结果大约是血浆的50%（ 30-
80% ），可能是因为血液凝固的过程中HIV颗粒被
包裹在纤维蛋白网络中，导致血清中病毒的浓度下
降。因此，测定病毒载量应该首选血浆标本，血浆
也是临床使用的唯一标本。血清标本对于研究也是 可以接受的，重要的是每位病人使用的标本类型应
始终保持一致。
抗凝剂 ：抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠
处理的血浆不适合做Amplicor HIV-1 Monitor试验， 因为肝素是PCR反应的一个潜在的抑制剂。如果必 须用RT-PCR方法测量肝素处理的血浆，可以向标 本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素处理的血 浆中病毒颗粒降解的速率显著高于EDTA钠盐和枸 橼酸钠处理的血浆，一般情况下不同抗凝剂处理的 血液6小时之内HIV RNA的降解速率分别是1.8%/小 时（EDTA）、3.3%/小时（枸橼酸钠）和5.0%/小 时（肝素）。在血液处理方法相同的条件下，用 EDTA钠盐抗凝的血浆结果显著优于枸橼酸钠和肝 素，因此EDTA钠盐是首选的抗凝剂。
NucliSens HIV-1定量实验有了较大改进，将NASBA核酸扩增技术与实时(realtime)检测技术结合起来,能够对检测进行实时监控。结果表达方式由每毫升标本 的拷贝数（cp/ml）改变为每毫升国际单位（IU/ml）。 可扩增HIV-1 M组的A-G亚型。
NucliSens 核酸分析系统利用三项技术： 专利的BOOM核酸提纯技术:手 工 manual 半自动miniMAG 自 动 easyMAG “扩增RNA”的NASBA技术 使用荧光分子信标（molecular beacon)对扩 增产物的实时检测技术
扩增HIV-1 M组的A-H亚型。
本实验系统检测的定量范围为50至500,000HIV-1 RNA拷贝
/ml。 检测结果以如下形式报告： 低于最低定量限的值报告为“<50” HIV-1 RNA拷贝/毫升。 在最低定量限和最高定量限之间的值报告为实际检测值。 高于最高定量限的值报告为“>500,000” HIV-1 RNA拷贝/ 毫升。 高于500,000HIV-1 RNA拷贝/毫升的样本位于检测的最高定 量限以上，必须适当稀释以获得确切的量值。在人血浆中稀 释高浓度样本，稀释用血浆需经VERSANT HIV-1 RNA3.0 Assay (bDNA) 检测鉴定不含HIV-1 RNA，按照实验流程重 新检测，得出的结果乘以稀释倍数以确定初始样本的病毒载 量。

疑难样本的辅助诊断 在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反 应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染 早期或终末期的证据。但在一般情况下，抗 体检测足以对HIV感染与否作出正确诊断。
病程监控及预测 HIV感染后病毒载量的变化具有一定的规律， 这种变化与疾病的进程密切相关。定期进行 病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段， 以确定相应的治疗方案。HIV病毒载量与6 年发病率的关系： 病毒载量(拷贝/毫升) 6年发病率（%） <500 5.4 501-3000 16.6 3001-10000 31.7 10001-30000 55.2 >30000 80
标本处理时间：HIV-1在体内进行快速转换，
平均半衰期是大约6个小时。HIV-1在体外未 处理的全血中也快速降解，全血中HIV RNA 的降解速率在6小时之内平均是9% （0.04log）,最大的降解速率是在采血以后68小时，采血以后30小时内可能减少0.5log。 因此为了减少病毒颗粒降解对检测的影响， 应该在采血以后6小时之内分离血球和血浆。
样品的保存温度： -70℃室温冻融3次，HIV RNA变化的幅度小于
0.2log。 -70℃保存5个月，HIV RNA减少0.3-0.5log。保存 12个月，HIV RNA减少一般不超过0.4log. 血浆在室温或4 ℃保存3天，HIV RNA减少不超过 0.5log。 -20 ℃保存2-3年，病毒载量大约减少50%左右。反 复冻融影响更大。




COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验包 括以下步骤： 样本制备 靶RNA的逆转录产生cDNA 用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增 通过比色进行与探针结合的扩增产物的测定
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR 试剂
对HIV-1病毒RNA的定量检测是采用HIV-1定 量标准品来完成的。HIV-1定量标准品是包括 作为HIV-1靶RNA引物结合部位和HIV-1扩增 子单一探针结合区的非感染性RNA转录物。 将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个 样本中和HIV-1靶序列一起共同进行样本制备、 逆转录、PCR扩增、杂交和检测。COBAS AMPLICOR 分析仪根据HIV-1定量标准品的 数据计算每一个样本的HIV-1RNA 的含量。 可扩增HIV-1 M组的A-H基因亚型。
线性范围
核酸提取
硅胶固相吸附 •异硫氰酸胍裂解，提纯效率高，核酸 纯度高，操作可见 •可与全自动核酸提取仪配套使用，提 纯效率高，操作简便
不需纯化核酸 •异硫氰酸胍裂解 •标本只使用于EDTA 抗 凝血浆
厂家 扩增
bioMerieux NASBA 适用RNA,等温扩增无需 温度循环，产物为RNA, 全程在单一密封管内进 行，无污染问题。在扩 增的同时进行检测，效 率高 分子信标实时检测 荧光信号，敏感性高， 检测范围广
bDNA方法(分枝DNA杂交试验)
NASBA(核酸序列扩增试验)
Cobas Amplicor HIV-1 Monitor(逆转录聚合酶链反应) 荧光定量PCR

bDNA 是一种夹心式的核算杂交反应过程，用于直接定量检测血浆中HIV-1 RNA 的含量。首先，通过离心将血浆中的HIV-1 富集起来。HIV-1 病毒基因组RNA从 病毒颗粒中释放出来后，首先会被一组合成的寡核苷酸探针又称捕获探针所结合 并连接在微孔板上，然后通过另外一些靶定探针使病毒RNA与预放大探针结合。 捕获探针包括十七个可与基因组特异结合的捕获位，靶定探针包括81个可与基 因组特异结合的靶定区，分别靶定在病毒RNA pol 基因的不同区段。放大探针结 合到预防大探针上，从而形成支链DNA复合体。随后多拷贝的碱性磷酸酶（AP）
病毒载量检测方法及检测意义
新疆疾病预防控制中心 佐合拉.吐尔地 2012-05-16 伊宁市
病毒载量（viral load）代表的是病毒的负荷，
即体内复制的病毒的数量。实际上，体内复 制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用 每毫升血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的 病毒载量。
一、通常的病毒载量测定方法