重组酶介导的核酸快速扩增法
重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)方法的建立
重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)方法的建立梁君妮; 尹伟力; 谢爽; 刘宁; 段效辉; 林森【期刊名称】《《中国预防兽医学报》》【年(卷),期】2019(041)010【总页数】4页(P1037-1040)【关键词】重组酶聚合酶扩增技术; 快速检测; 鲤春病毒血症病毒【作者】梁君妮; 尹伟力; 谢爽; 刘宁; 段效辉; 林森【作者单位】烟台海关技术中心山东烟台 264000【正文语种】中文【中图分类】S852.65鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)属水泡病毒属(Vesiculovirus)，是一种弹状病毒[1]，主要流行于欧洲、中东和俄罗斯，近几年蔓延至美洲和亚洲[2-4]。
SVCV 宿主范围非常广泛，四大淡水鱼类均能被感染，其中最易感的为鲤科鱼类，尤其仔鱼，一旦感染死亡率可达70 %[5]。
它可以引起鱼类大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)，是世界动物卫生组织(OIE)必须通报的动物疾病。
SVCV 传统的检测方法是细胞培养分离法，但该方法费时费力。
近年来检测SVCV 的分子生物学方法被广泛研究并应用。
其中重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymerase amplification，RPA)方法可以在25 ℃～42 ℃恒温条件下20 min内快速完成核酸扩增，无需昂贵的变温仪器，反应迅速，灵敏度高，扩增产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进行检测[6-8]，适合现场快速检测。
本研究依据SVCV G 基因保守序列设计特异性引物，利用RPA 技术建立一种简便高效、特异性强、灵敏度高的SVCV 检测方法，适用于设备简单的基层实验室及现场检测，是SVCV日常监控及检测的有效手段。
1 材料与方法1.1 主要实验材料 SVCV 由本实验室保存。
传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)和传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)均由深圳出入境检验检疫局提供。
禽流感病毒H5N1的重组酶介导检测方法学研究
CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY禽流感病毒H5N4的重组酶介导检测方法学研究陈淑丹I廖静I王玲I罗鹏I郭利川2郑伟广吴忠华I应清界2摘要采用逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(Reverse Transcription Recombinase-aided amplification,RT-RAA)建立检测禽流感病毒H5N1的快速方法，根据禽流感病毒H5N1保守序列设计引物及探针，将H5N1RNA逆转录为cDNA,然后以cDNA作模板.扩增检测病毒核酸序列本研究构建了带有H5N1核酸序列的质粒，以此为模板检测不同浓度的质粒.分析该方法的灵敏度，对已知样本进行检测来验证方法的特异性.设计的H5N1特异性引物和探针，能在3『C恒温下，10-30min可有效扩增岀相应病毒的核酸.与其他流感病毒无交叉反应；对质粒的检测灵敏度可达10拷贝建立的RT-RAA检测禽流感病毒H5N1方法灵敏度和特异性均较髙.且该方法操作简单，适用于禽流感病毒H5N1的快速检测关键词禽流感病毒H5N1；逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)；分子检测Rapid Detection of H5N1Avian Influenza Virus Based onRAA Fluoresce n ee AssayCHEN Shu-Dan1LIAO Jing1WANG Ling1LUO Peng1GUO Li-Chuan*12ZHENG Wei1,WU Zhong-Hua1YING Qing-Jie2Abstract A quick assay of detecting H5N1avian influenza virus was established through reverse transcription recombinase-aided amplification assay(RT-RAA).H5N1avian influenza virus RNA was transcribed into the cDNA by a reverse-transcription reaction,which served as template for RAA amplification.We design universal primer and probe according to the conserved nucleic acid sequence of H5N1virus.Then constructed plasmid and clinical samples were used to evaluate the specificity and sensitivity of the method.The results showed that nucleic acids of H5N1could be well amplified with specific primer and probe,while nucleic acids of other viruses had negative amplification results.The whole reaction was completed within30minutes under constant temperature of 39°C.The study indicates that the RT-RAA method is very sensitive and able to detect10copies.The established RT-RAA assay had high sensitivity and specificity,ready-to-hand for rapid detection of H5N1avian influenza virus.Keywords H5N1avian influenza virus；reverse transcription recombinase-aided amplification(RT-RAA)；molecular detectio n基金项目:海关总署科研项目(2019HK139)通讯作者：郑伟(1979-),男，汉族，杭州人，博士，主任医师.主要从事口岸病原体检测工作，E-mail：*************** 1•杭州国际旅行卫生保健中心(杭州海关口岸门诊部)杭州3100122.江苏奇天基因生物科技有限公司无锡2141351.Hangzhou Intemationai Travel Healthcare Center(Hangzhou Customs Port Outpatient Departments),Hangzhou3100122.Jiangsu Qitian Gene Bio-Sci&Tech Co.Ltd,Wuxi2141354中国口岸科学技术禽流感病毒可通过空气传播，引起急性呼吸道感染高致病性禽流感H5N1曾在亚洲、欧洲和非洲引起大量家禽的流感暴发野生鸟类包括海鸟、海鸥和家鸭被认为是病毒的天然宿主。
重组酶聚合酶扩增技术发展趋势
重组酶聚合酶扩增技术（PCR）作为一种在分子生物学领域应用广泛的技术，已经在科学研究、医学诊断、法医学和环境监测等领域发挥着不可替代的作用。
随着科学技术的不断进步和发展，PCR技术也在不断地演变和改进。
本文将就重组酶聚合酶扩增技术的发展趋势进行探讨，分析未来可能的发展方向和应用前景。
一、新一代PCR技术的出现随着生物技术领域的快速发展，新一代PCR技术不断涌现。
数字PCR 技术的出现，可以实现对DNA的绝对定量，有望广泛应用于癌症早期诊断和评估、胚胎植入前诊断等领域。
环介导等温扩增技术的兴起，使得PCR技术的使用更加简便和快速，有望在临床快速诊断中得到广泛应用。
二、PCR技术与人工智能的结合随着人工智能技术的快速发展，PCR技术也将不可避免地与人工智能技术结合。
人工智能可以帮助分析PCR实验的大量数据，寻找数据之间的关联，加快实验结果的解读和分析。
人工智能还可以在PCR实验设计阶段提供智能化的建议和优化方案，提高PCR技术的效率和准确性。
三、微流控技术在PCR中的应用微流控技术是近年来分析化学领域的一个热点，该技术可以在微型芯片上实现对样品的稀释、混合、加热等一系列操作，结合PCR技术，可以实现对DNA的快速扩增和检测。
微流控技术的应用有望将PCR技术推向微型化、智能化和自动化的方向，提高PCR技术的高通量分析能力。
四、CRISPR技术与PCR的结合CRISPR技术作为一种精准的基因编辑技术，与PCR技术的结合有望在基因诊断和基因治疗领域发挥重要作用。
利用PCR技术快速扩增基因片段，然后结合CRISPR技术对特定基因进行精准编辑，可以为许多遗传病的治疗提供新的思路和方法。
五、PCR技术在环境监测中的应用PCR技术在环境监测中的应用也是一个备受关注的领域。
利用PCR技术可以快速检测水体中的致病微生物和污染物，为环境保护提供重要的技术支持。
未来，随着PCR技术的不断改进和完善，其在环境监测中的应用前景将更加广阔。
重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌
重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌1. 引言1.1 背景介绍创伤弧菌是一种常见的致病菌，主要存在于海水和淡水中，同时也可在生鲜水产品中被检测到。
感染创伤弧菌会引起人类和动物的创伤性疾病，严重时可能导致败血症和坏死性皮肤病等严重后果。
由于其耐热性和抗生物药性强，创伤弧菌在临床和食品安全领域的监测和控制备受关注。
传统的创伤弧菌检测方法存在着操作复杂、耗时长、灵敏度低等问题，难以满足迅速准确的检测需求。
开发一种快速、灵敏、简便的检测技术对于创伤弧菌的监测具有重要意义。
1.2 研究目的本研究旨在探讨重组酶聚合酶扩增技术（RPA）在创伤弧菌检测中的应用，并分析其在该领域中的优势和局限性。
创伤弧菌是一种常见的致病菌，经常引起食物中毒和水污染等问题，对人类健康构成威胁。
通过研究RPA技术在创伤弧菌检测中的表现，我们希望能够为提高创伤弧菌的快速、准确检测水平提供科学依据。
我们还将探讨RPA技术在创伤弧菌检测中的前景，并提出未来研究方向，为该领域的发展提供参考和指导。
本研究旨在为解决创伤弧菌检测中存在的问题，保障食品安全和公共健康做出贡献。
2. 正文2.1 重组酶聚合酶扩增技术(RPA)原理重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的核酸扩增技术，其原理基于同源重组DNA修复机制。
该技术利用特殊的重组酶在等温条件下介导两个互补的引物与靶序列结合，形成DNA双链，然后通过DNA聚合酶的作用在靶序列上合成新的DNA链，实现核酸扩增。
RPA在温度较低(37-42摄氏度)下运行，不需要复杂的仪器和设备，使其成为一种便携式的核酸扩增技术。
RPA技术的原理是基于同源重组原理，依赖于专一性的重组酶和DNA结合蛋白，实现引物与靶序列的结合和合成新的DNA链。
这种技术可以在短时间内完成核酸扩增，且具有高敏感性和特异性，能够在复杂的样品中准确检测目标DNA。
RPA技术的原理简单而高效，为快速检测创伤弧菌提供了新的可能。
通过结合RPA技术与其他技术的优势，可以更快速、更可靠地检测创伤弧菌，为预防传染病提供有力支持。
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展
ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ 。 ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ＲＰ Ａ． ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｅ ｌ ｄ ｓ ａ ｔ ｈ ｏ ｍｅ ａ ｎ ｄ ａ ｂ ｒ ｏ ａ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｌ ａ ｓ ｔ ｄ ｅ ｃ ａ ｄ ｅ ａ ｒ ｅ ｓ ｕ ｍｍ ａ ｒ ｉ ｚ ｅ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ＲＰ Ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｆ ｅ ｌ ｄ ｉ Ｓ ａ ｌ ｓ ｏ ｐ ｒ ｏ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ．
１ 前 言
利用 重组 酶和 单链 结合 蛋 白在 常 温下协 同实现 引物 和模 板 的特异 结合 。 反应 体 系主要 有 Ｔ ４噬菌 体编码 的重 组 酶蛋 白 ｕ ｖ ｓ Ｘ和 ｕ ｖ ｓ Ｙ Ｅ ￣ 、 单链 结 合蛋 白ｇ ｐ ３ ２及 Ｂ ｓ ｕ Ｄ Ｎ Ａ聚合 酶 、 引物 、 模板 、 缓 冲液等 ［ ２ １ 。 在恒 温下 ． 重 组 酶蛋 白在 Ａ Ｔ Ｐ的参 与下 与单 链 核酸 （ 引物 ） 结 合形成 蛋 白一 核苷 酸复合 物 ， 该复合 物 可 以在 双链 Ｄ Ｎ Ａ（ 模板 ） 上 进行 双 向扫 描 ， 寻 找 与引 物同源的靶序列 。 一旦找到 ， 重组酶可打开双链Ｄ Ｎ Ａ， 同 时引 物与 同源 序列 发生链 交换 反应 ， 在Ｄ Ｎ Ａ聚合 酶 的作 用下启 动 Ｄ Ｎ Ａ合成 反应 。 单 链结 合蛋 白与 被引 物替 换掉 的母链 结合 ， 防止被 进一 步替换 。 在这个 体 系 中 ．由一对 相对 的引 物 同时启 动和完 成一 个合 成
重组酶聚合酶扩增技术
重组酶聚合酶扩增技术
重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一种新型的灵敏、快速、低成本的核酸扩增技术，它结合酶催化的DNA复制和模板识别性聚合酶促进DNA复制，在短时间内实现大量DNA扩增，可广泛用于检测病毒、细菌和肿瘤等疾病。
RPA技术主要由重组酶和聚合酶组成，它们能够有效地调节DNA 复制，有效地实现大规模DNA扩增。
重组酶可以有效地识别模板DNA，分解它们，将分解的DNA片段与新的碱基配对，从而创建一个合成的DNA片段。
聚合酶能够高效地连接碱基，形成一个双链DNA特有的发光结构，并能够有效地将其复制为许多份。
RPA技术可以在体外快速、准确地检测病毒、细菌和肿瘤等疾病，它非常适合用于医疗诊断和病毒检测，可以准确快速地实现病毒检测。
此外，RPA技术的成本低、灵敏度高，可以在实验室或现场快速检测病毒，改善患者的诊断效果。
因此，重组酶聚合酶扩增技术是一种新型的灵敏、快速、低成本的核酸扩增技术，广泛用于病毒、细菌和肿瘤等疾病的检测，可以改善患者的诊断效果，并在实验室和现场快速准确地检测病毒。
重组酶辅助扩增结合_CRISPR
引文格式：殷冬冬, 郭浩, 兰梦蝶, 等. 重组酶辅助扩增结合 CRISPR/Cas13a 检测禽腺病毒4型方法的建立[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2023, 38(5): 803−807. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202211058重组酶辅助扩增结合 CRISPR/Cas13a 检测禽腺病毒4型方法的建立*殷冬冬1,2， 郭 浩3， 兰梦蝶4， 尹 磊1,2， 王洁茹1,2， 沈学怀1,2， 戴 银1,2， 潘孝成1,2 **(1. 安徽省农业科学院 畜牧兽医研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，安徽 合肥 230001；2. 畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，安徽 合肥 230001；3. 肥西县农业农村局动物卫生监督所，安徽 合肥 231200；4. 宁国市动物卫生监督所，安徽 宁国 242300)摘要: 【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)检测方法。
【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification ，RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关 Cas13a 蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a ，CRISPR-Cas13a)技术相结合，针对FAdV-4 Hexon 基因保守区设计RAA 引物及CRISPR RNA (crRNA)，利用 RAA 技术扩增样本核酸，并进行 CRISPR-Cas13a 荧光检测，以qPCR 为对照方法，评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR 法的一致性。
【结果】本研究所建立的方法反应过程均在 37 ℃恒温条件下完成，反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL ，灵敏度高，且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b 、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用杜亚楠;赵笑;范小瑞;张琪;赵凯;许燕【摘要】重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的恒温核酸扩增技术.本文介绍了RPA技术的扩增原理、引物设计、成本分析及产物检测等内容,归纳了RPA技术与其他等温扩增方法的优缺点,并对RPA技术在病原微生物、基因突变和食品安全检测中的应用现状进行了阐述.希望RPA技术可以得到更多生物学家的关注,更好地应用于生命科学的各个领域.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)006【总页数】6页(P117-122)【关键词】重组酶聚合酶扩增;核酸检测;引物设计;产物检测;研究进展【作者】杜亚楠;赵笑;范小瑞;张琪;赵凯;许燕【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234【正文语种】中文【中图分类】Q78核酸体外扩增技术是生命科学研究中最常用的技术之一。
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR)发明于1983年，目前已经成为应用最为广泛的核酸扩增技术[1]。
该技术特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的控温循环仪，难以推广到现场检测。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，恒温核酸扩增技术的出现解决了PCR技术在仪器上的局限性。
该技术不需要温度循环且反应更加快速，非常适用于资源有限地区的现场检测[2]。
目前已报道的的恒温扩增技术有十几种[3]。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术[4]，可在23—45℃下连续进行反应，反应时间只需5—20min，特异性强、灵敏度高，非常适用于疾病诊断和现场检测。
rpa重组酶聚合酶扩增 标准
RPA重组酶聚合酶扩增标准操作规程一、反应体系RPA反应体系主要由以下成分组成：引物：用于指导RPA扩增反应的特异性DNA序列。
重组酶：催化DNA链的合成和延伸。
单链DNA结合蛋白：保护单链DNA免受核酸酶的降解。
链置换DNA聚合酶：在RPA反应中，与重组酶共同作用，延长DNA链。
缓冲液：提供合适的pH环境和离子浓度，确保RPA反应的顺利进行。
dNTPs：提供合成DNA所需的原料。
二、反应条件RPA反应通常在30-40℃下进行，反应时间根据目标DNA 片段的大小而异，一般介于30分钟至2小时之间。
为确保反应的一致性和可重复性，建议在恒温条件下进行RPA反应，并定期校准温度探头。
三、质量控制引物特异性：确保引物与目标DNA序列的特异性结合，避免非特异性扩增。
模板纯度：确保模板DNA无降解或污染。
反应体系一致性：每次反应均应加入相同量的各个成分，以保证结果的稳定性和可重复性。
实时监测：在RPA反应过程中，通过实时监测荧光信号的变化，可有效监控反应进程和产物量的变化。
阴性对照和阳性对照：设立阴性对照和阳性对照，以监测实验的污染情况以及验证实验的有效性。
四、安全性RPA试剂储存：将重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶等关键试剂储存在-20℃以下，以保持其活性。
避免交叉污染：确保所有试剂和模板均已灭活或去除活性，防止交叉污染导致假阳性结果。
个人防护措施：进行RPA实验时，应穿戴适当的个人防护装备，如实验服、化学防护眼镜、一次性手套等。
废弃物处理：将使用过的废弃物按照生物废弃物的规定进行处理，防止有害物质的泄漏。
五、实验记录在进行RPA实验时，应详细记录以下信息：实验日期、时间及操作者信息。
使用的引物序列及浓度。
使用的模板类型及浓度。
RPA反应的条件，如温度、时间等。
实验结果，包括电泳图谱、荧光信号曲线等。
对实验结果的解释和判断。
如果可能，保存所有实验数据的电子版本和纸质版本，以便查阅和审核。
重组酶介导的核酸快速扩增法
重组酶介导的核酸快速扩增法重组酶介导的核酸快速扩增法摘要：体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术。
重组酶介导的扩增(recombinase-aid amplification,RAA)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。
RAA 法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶代替了传统PCR 的热循环解链过程, 实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环PCR 反应。
Abstract :Nucleic acidamplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be rapidly amplified in vitro. Recombinase-aid amplification (RAA) is the most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out atoptimized37°C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.关键词：重组酶体外核酸扩增在过去１０年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展[1]，如SDA 技术、TM A 技术、HDA 技术、LAMP 技术和RPA ／RAA 技术等。
梨火疫病菌的RPA快速检测技术的研发
梨火疫病菌的RPA快速检测技术的研发作者：蒲姝旸张瑾逸暴晓阳孟青青田茜蔡璐璐赵文军来源：《植物保护》2024年第04期關键词梨火疫病；快速检测；重组酶聚合酶扩增（RPA）；实时荧光型RPA;侧流层析试纸条型RPA梨火疫病1780年在美国纽约州首次发现，当时人们认为是雷电、冻伤、热灼伤、昆虫，甚至是人类病原菌引起的。
1884年美国伊利诺伊大学的Burr-ill教授通过分离与再接种试验证实了该病是由一种细菌引起的，这也是世界上最早被发现的一种植物细菌病害。
梨火疫病菌在寄主上主要有4种存在形式：菌脓、菌束、表生细菌、内生细菌，其中菌脓是梨火疫病菌最常见的存在形式。
梨火疫病菌的寄主范围广泛，可以侵染40多个属的220多种植物。
植物的花朵、幼果和叶片在受到梨火疫病菌侵染之后会很快变成黑褐色的焦枯状，像被火烧过一样，造成果树大面积减产。
截至2020年底根据欧洲和地中海植物保护组织（European and Mediterranean Plant ProtectionOrganization，EPPO）数据显示，梨火疫病在美洲、欧洲、非洲、亚洲以及大洋洲的60多个国家发生与分布口。
我国近年来也不断从国外批量进口果树苗木以及果品，稍有不慎就可能将梨火疫病菌带入我国。
2019年，李洪涛等通过室内接种幼果和离体枝条的方法评价了市面上常见的20个梨品种对梨火疫病菌的抗病能力，结果显示：供试的梨品种中没有发现高抗品种，其中70%品种不同程度地感病，因此对于梨火疫病菌的检疫应引起高度重视。
梨火疫病菌的检测方法目前主要是组织分离培养、免疫学检测以及分子检测。
组织分离培养是对有明显发病症状的植物材料采用半选择性培养基直接分离病原菌，再根据梨火疫病菌在不同培养基上的菌落生长特征做出初步鉴定。
免疫学检测包括：凝集反应、免疫磁珠分离技术、酶联免疫分析技术和免疫荧光技术等。
分子检测是当前应用最广的检测方法。
近几年，在传统PCR检测的基础上又开发了real-time PCR、巢式PCR、免疫捕获PCR和免疫吸附PCR 技术，进一步提高了检测的便捷性和准确率。
一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法[发明专利]
![一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/fa5c37d2580216fc710afdc3.png)
专利名称：一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法
专利类型：发明专利
发明人：陈淑丹,刘伟,何蕾,鲍泽英,郭利川,刘小曼,汤赛君,王智宏,王秀东,应清界
申请号：CN201510899042.8
申请日：20151209
公开号：CN105779583A
公开日：
20160720
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种利用等温核酸扩增技术快速检测结核分枝杆菌的方法，该检测方法包括重组酶介导等温核酸扩增体系、反应缓冲液和结核分枝杆菌检测通用引物。
该方法在等温条件下(35-45℃)进行，10-20分钟内，即可实现对结核分枝杆菌DNA的扩增。
本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，便于现场及临床上的应用，该方法适用于对结核分枝杆菌的快速检测。
申请人：江苏奇天基因生物科技有限公司,浙江国际旅行卫生保健中心
地址：214135 江苏省无锡市新区菱湖大道97号兴业楼C栋505室
国籍：CN
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增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂[发明专利]
![增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/996509df4bfe04a1b0717fd5360cba1aa8118c0c.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910414614.7(22)申请日 2019.05.17(71)申请人 杭州众测生物科技有限公司地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街道滨安路688号5幢19层1901室(72)发明人 程奇 黄震巨 邱宪波 张建勋 (74)专利代理机构 杭州天昊专利代理事务所(特殊普通合伙) 33283代理人 向庆宁(51)Int.Cl.C12Q 1/6848(2018.01)(54)发明名称增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂(57)摘要本发明公开了一种磁性钢珠用来增加RAA恒温扩增灵敏度的方法及其在核酸分析及检测、医学诊断中的应用，属于生物医学工程领域。
其中包括(1)磁性珠的材料选择、(2)磁性钢珠的直径优化、(3)磁性钢珠的混合时间的优化、(4)磁性钢珠对RAA恒温检测灵敏度增加检测方式，其中磁性珠的材料选择为钢性，磁珠的直径选择为1.5mm，磁性钢珠的混合时间30s，恒温RAA结果的检查方式可以为琼脂糖凝胶、荧光检测，在此条件下磁性钢珠对RAA恒温扩增的灵敏度提高了10倍相对于未加钢珠，提高了100倍相对于其他类型的荧光检测仪。
本发明磁性钢珠能够显著提高RAA恒温扩增的灵敏度，使得其在核酸快速检测、临床诊断上有较大的应用场景。
权利要求书1页 说明书12页序列表1页 附图2页CN 110408681 A 2019.11.05C N 110408681A1.一种恒温扩增样本中核酸的方法，包括：让核酸扩增的必须的试剂，其中，在扩增试剂中添加磁性珠子，其中，珠子的直径为0.5毫米-3毫米。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的磁珠珠子选自特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、铁珠、钢珠、钨钢珠、镍珠中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的珠子为磁性钢珠。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的珠子的直径为1-1.5毫米。
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重组酶介导的核酸快速扩增法摘要：体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术。
重组酶介导的扩增(recombinase-aid amplification,RAA)技术是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。
RAA 法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶代替了传统PCR 的热循环解链过程, 实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环PCR 反应。
Abstract:Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be rapidly amplified in vitro. Recombinase-aid amplification (RAA) is the most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at optimized37°C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.关键词：重组酶体外核酸扩增在过去１０年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展[1]，如SDA技术、TM A技术、HDA技术、LAMP技术和RPA／RAA技术等。
本文介绍的重组酶介导扩增(r ecombinase-aid amplification,RAA)技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。
与RPA 不同的是, RAA 扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶[2]。
在37℃恒温下, 该重组酶可与引物DNA 紧密结合, 形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA 上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(singl estrandedDNA binding, SSB)的帮助下，使模板DNA 解链，并在DNA 聚合酶的作用下，形成新的DNA 互补链。
反应产物也是以指数级增长，通常在1 h 内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段[3]，整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
1材料与方法1.1 蛋白和DNA天蓝色链霉菌重组酶蛋白(SC-recA)和枯草芽孢杆菌重组酶蛋(BS-recA)分别来自天蓝色链霉菌和枯草芽孢杆菌.将天蓝色链霉菌、枯草芽孢杆菌重组酶基因分别克隆至pET21a表达载体中，过量表达后用Ni-NTA 亲和层析纯化，并用Bradfo-rd 法定量。
重组DNA 是rnd 基因编码区的一部分(310 bp)，将此片段连接到载体上，转化大肠杆菌获得含重组DNA 的菌株(Top10)。
1.2 RAA 扩增将含有目的片段的大肠杆菌Top10 菌株过夜培养，从中取出1 mL 菌液，100℃加热10 min。
冷却至室温，从中取出1 μL 作为扩增模板。
引物A、B 大小分别为34 和32 nt。
反应体系如下：50 pmol 引物A；50pmol 引物B； 1 mmol/L dNTP；90 ng/μL SSB 蛋白；120ng/μL recA 重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)；30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶；反应缓冲液(100 mmol/L Tricine，pH 8.0；100 mmol/L 醋酸镁；5mmol/L 二硫苏糖醇；5%PEG 20K；2.5 mmol/L ATP；100 ng/μL 肌酸激酶)。
摇匀后放置于37℃培养箱温浴1 h。
取10 μL 反应产物经酚/氯仿提纯后，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。
2 结果与分析在细菌或真菌DNA 复制过程中，重组酶蛋白起着重要的作用。
重组酶蛋白可与单链DNA 结合而阻止细胞核内核酸酶对单链DNA的降解，在DNA重组过程中，重组酶还负责基本的碱基配对[4]。
当然，在体内，还会有其他辅助性蛋白，如recB，recC 和单链DNA 结合蛋白等，共同参与到DNA 的重组中。
因此，在进行核酸体外扩增时，重组酶蛋白无疑是起着决定性作用的反应催化剂。
为了验证重组酶的作用，设计了有针对性的RAA 扩增体系，除了SC-recA、BSrecA重组酶外，还加入了DNA 聚合酶和辅助蛋白Bsu 等。
实验结果表明，在目前的反应体系中，含有SC-recA 和BS-recA 重组酶的反应体系都可以正确扩增出目的片段，说明SC-recA 和BS-recA 重组酶均具有催化功能，而且反应的特异性很高。
扩增的目的片段长310 bp，是之前克隆到载体里的rnd 基因编码区的一部分。
3 讨论3.1 重组酶蛋白在RAA 反应中的作用重组酶都能够与DNA 紧密结合，这是使核酸体外扩增反应顺利进行的关键一步。
在体外核酸扩增体系中，重组酶蛋白的作用是帮助DNA 模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换，随后在DNA 聚合酶的催化下，扩增出新的DNA 片段[5]。
这一替换过程需要ATP 来提供能量，然后在单链结合蛋白的辅助下，Bs u DNA 聚合酶可以对链替换后的目的DNA 进行特异地延伸。
由于ATP 在CK激酶催化下可以利用磷酸肌酸(phosphocreatine)实现再生，使这一反应过程中的化学平衡倾向于产物的合成，并且这一过程可以被不断地重复，从而最终实现核酸的高效扩增。
3.2 重组酶介导扩增法反应的建立和优化在RAA 反应中，酶无疑是最重要的成分，酶的纯度直接决定了反应能否顺利进行，因为反应仅在37℃下进行，任何不必要的杂质都会影响到反应的结果，特别是核酸酶的污染，而核酸酶在传统的高温PCR 中几乎可以被忽略。
因此，在进行酶的纯化时，特别强调核酸酶的去除，以及保持酶的活性。
通过Ni-NTA 亲和层析(Ni-NTA agarose)可以去掉大部分杂质，获得高纯度的酶.每个反应中酶的定量也很重要，除了重组酶,还有3~4 个酶参与扩增反应，它们之间需要合理的比例，才能够得到预期的扩增结果。
RAA常温核酸扩增法对模板是不挑剔的，可以是质粒DNA，也可以是含有质粒的菌液，动植物DNA均可以作为模板。
甚至可以使用RNA 直接作为模板，而无需额外的逆转录过程。
但是为了提高扩增片段的准确性，RAA 对引物的要求比较严格。
通常1 对引物需要由30~34 个核苷酸组成，且引物的序列要与扩增片段严格互补，只有这样，才能获得理想的扩增条带。
RAA方法中引物与模板严格互补的特点，使其可以用于SNP 和甲基化的检测，只要与引物配对的模板DNA上有一个碱基的差异，就可以用RAA 方法检测出来。
在RAA 反应体系的优化中，缓冲液也是关键的部分。
因重组酶催化的反应是一个耗能的反应，需要ATP 的参与，所以在缓冲液中，ATP 和促使ATP 再生的肌酸激酶(creatine kinase)都是必不可少的成分。
同时，加入了有稳定和提高酶活性作用的聚乙二醇(PEG20000)和二硫苏糖醇(DTT)等。
整个反应在一个弱碱的环境下进行，Tris 缓冲液的pH 为8.0.经过优化的反应体系在简单的反应条件下(3 7℃反应1 h)，已经基本上能够稳定地扩增大小为310 bp的目的片段，而且具有很高的特异性。
3.3 RAA 常温扩增的应用前景ＲＡＡ技术的优势使其有望在很大程度上代替传统的ＰＣＲ技术。
由于传统的ＰＣＲ技术受仪器和空间的限制，使得现有核酸扩增技术的应用价值没有被充分挖掘出来。
ＲＡＡ技术不依赖于ＰＣＲ仪器的便捷性能，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。
此外，ＲＡＡ技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套ＲＡＡ多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式ＰＣＲ技术无法相比的特点。
随着ＲＡＡ技术的进一步深化、完善，在ＲＡＡ技术的基础上可以很快地研发出适合家庭使用的分子诊断试剂，使全国乃至全球对病毒性和遗传性疾病的定期和快速普查在技术上成为可能。
这将是一个非常巨大的潜在市场，其经济意义不可估量。
结合其他优秀技术，如发展免疫ＲＡＡ，可使检测对象从核酸扩大到蛋白质、糖类或其他大分子化合物。
同时，ＲＡＡ技术也可作为一种基础的研究手段，进一步促进分子生物学的研究。
ＲＡＡ技术极有可能帮助功能基因组学和植物分子生物学获得突破性进展，进而形成更加巨大的生物科技产业。
[参考文献][1] Gill p, Ghaemi A, Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. Nulcleo sides, nucleotides＆nucleic acids, 2008, 27:224-243[2] 彭涛. 核酸等温扩增技术及其应用. 北京: 科学出版社, 2009. 98[3] 吕蓓，程海荣，严庆丰，等．用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸．中国科学：生命科学，2010,40(10):983-988.[4] Kuzminov A. DNA replication meets genetic exchange: cromosomal damage and its rep air by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 8461—8468[5] 吕蓓,张志芳等体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新。
中国生物工程杂志, 2011, 31(3):91-96。