基因沉默的工具-RNA+干扰技术的研究进展

Ｊ］ ． ｖａｌｕｅ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡｉ －ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ［ ２０１４ ，１２ （ ７） ：８２１ － ８３１ ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ， ［ ２］ Ｓｉｎｈａ Ｓ Ｋ．ＲＮＡｉ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ［ Ｊ］ ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｍ ｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔｓ， ２０１０ ，１６ （ ４） ： ３２１ － ３３２． ［ ３ ］ Ｙｏｕｎｉｓ Ａ ， Ｓｉｄｄｉｑｕｅ ＭＩ ， Ｋｉｍ Ｃ Ｋ， ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （ ＲＮＡｉ ） ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ： Ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｆ Ｈｉ －Ｔｅｃｈ Ｐｌａｎｔ Ｊ］ ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ， ２０１４ ，１０ （ １０ ） ：１ １５０ － １ １５８． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ［ ［ ４］ Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｊｉａ Ｙ， Ｚｈｅｎｇ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍａ Ｍ ｉｃｒｏＲＮＡ － １２２ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ， ａｌｃｏｈｏｌ － ， ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ － ｒｅｌａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ［ Ｊ］ ．Ｃｌｉｎ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ － Ｃｈｅｍ， ２０１０， ５６（ １２） ： １８３０ － １８３８． ［ ５］ Ｊａｑｔａｐ Ｕ Ｂ， Ｇｕｒａｖ Ｒ Ｇ， Ｂａｐａｔ Ｖ Ａ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ［ Ｊ］ ． Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， ２０１１ ， ９８（ ６） ： ４７３ － ４９２． ［ ６］ Ｋａｔｏｃｈ Ｒ，Ｔｈａｋｕｒ Ｎ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１３ ，１６９ （ ５） ：１５７９ － １６０５ ． ［ ７］ Ｋｈｒａｉｗｅｓｈ Ｂ ，Ｚｈｕ Ｊ Ｋ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０１２ ， ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ［ １９ （ ２） ：１３７ － １４８． ［ ８］ Ｄｏｑｉｎｉ Ｄ Ｂ ， Ｐｅｒｅｉｒａ Ｔ Ｃ． Ｔｈｅ ｎｅｗ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ＲＮＡｓ［ Ｊ］ ． Ｇｅｎｅｔ Ｍ ｏｌ Ｂｉ ｏｌ， ２０１４ ， ３７ （ １） ： ２８５ － ２９３． ［ ９］ Ｍ ｏｌｌａｉｅ Ｈ Ｒ，Ｍ ｏｎａｖａｒｉ Ｓ Ｈ，Ａｒａｂｚａｄｅｈ Ｓ Ａ ，ｅｔ ａｌ．ＲＮＡｉ ａｎｄ ｍｉＲ ＮＡ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒｓ ［ Ｊ］ ．Ａｓｉａｎ Ｐａｃ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ， ２０１３ ，１４ （ １２ ） ： ７０４５ － ７０５６． ［ １０ ］ Ｓｉｊｅｎ Ｔ，Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｆ Ａ ，Ｔｈｉｊｓｓｅｎ Ｋ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｉＲＮＡｓ ｒｅｓｕｌｔ ｆｒｏｍ ｕｎｐｒｉｍｅｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｏｒｍ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｌａｓｓ［ Ｊ］ ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ， ２００７ ， ３１５ （ ５８０９ ） ： ２４４ － ２４７． ［ １ １ ］ Ｇａｌａｓｓｏ Ｍ ， Ｓａｎａ ＭＥ． Ｎｏｎ － ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ： ａ ｋｅｙ ｔｏ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｊ］ ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｍ ｅｄ， ２０１０， １８（ ２） ： １１８６ － １１９３． ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ［ ［ １２ ］ Ｗｕ Ｊ， Ｈｕａｎｇ Ｗ． Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉ ａ ｒｅｖｉｅｗ［ Ｊ］ ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１３， ５３（ １） ： ６３０ － ６５４． ｌｅｎｃｉｎｇ： ［ １３ ］ 万志红，王宇明．基因功能研究新途径 －ＲＮＡ 干扰［ Ｊ］ ．世界华 ２００４ ，１２ （ ４） ： ９６２ － ９６４． 人消化杂志， ［ １４ ］ Ｋｅｓｈａｒｗａｎｉ Ｐ，Ｇａｊｂｈｉｙｅ Ｖ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２０１２， ３３（ ２９ ） ： ７１３８ － ７１５０． ［ １５ ］ Ｙｕ Ｄ Ｍ ， Ｈａｏ Ｌ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣｙｃｌｉｎＤ１ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇ１ ｐｈａｓｅ Ｊ］ ．Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｋｅｌｏｉｄ ［ ｐｈｙｓ， ２００８ ， ３５ （ ２） ：１５９ － １６９． ［ １６ ］ Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ Ｔ Ｒ，Ｂｅｒｎａｒｄｓ Ｒ，Ａｇａｍｉ Ｒ．Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘ Ｊ］ ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ， ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ［ ２００２ ， ２９６ （ ５５６７ ） ： ５５０ － ５５３． ［ １７ ］ Ｎｏｖｉｎａ Ｃ Ｄ，Ｍ ｕｒｒａｙ Ｍ Ｆ，Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ Ｄ Ｍ ，ｅｔ ａｌ．ｓｉＲＮＡ －ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ － １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［ Ｊ］ ． Ｎａｔ Ｍ ｅｄ ， ２００２ ， ８（ ７） ： ６８１ － ６８６． ［ １８ ］ Ｄｕｆｆ Ｃ Ｊ，Ｈｏｏｐｅｒ Ｎ Ｍ ．ＰＣＳＫ９ ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｊ］ ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１ １ ，１５ （ ２） ： ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ［ １５７ － １６８． ［ １９ ］ 何洁 凝，田 生 礼．ＲＮＡ 干 扰 的 研 究 进 展 ［ Ｊ］ ．生 命 科 学 研 究， ２０１４ ，１８ （ ３） ： ２６５ － ２６８． ［ ２０ ］ Ｚｈｏｕ Ｗ，Ｆｕ Ｘ Ｑ，Ｌｉｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＲＮＡｉ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｋｔ１ ｇｅｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｂｏｔｈ Ｊ］ ．Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ， ２０１２ ，１７６ （ １） ：１３ － ２１ ． ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ［ ［ ２１ ］ Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ Ｐ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｌ Ｊ． Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ａｄｖａｎｃｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［ Ｊ］ ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ， ２００８， １４（ １１ ） ： １６７０ － １６８１． ［ ２２ ］ Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ Ｍ ， Ｐｏｌａｋ Ｋ， Ｇａｌｋａ － Ｍ ａｒｃｉｎｉａｋ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｆｆ － ｔａｒｇｅｔ ｅ�
通讯作者： 余祖江， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｊｉБайду номын сангаасｎｙｕｅｍ＠ｚｚｕ． ｃｎ 。
河南医学研究 ２０１５ 年 １ 月第 ２４ 卷第 １ 期 ＨＥＮＡＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｊａｎ． ２０１５ ，Ｖｏｌ． ２４ ，Ｎｏ． １
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短实验时间， 随着 ＲＮＡｉ 技术的不断完善， 它必将成为基因研究 的强力工具。 ３． ２ 疾病治疗的新方法 ＲＮＡｉ 技术还被广泛应用于肿瘤、 病 １６ ］ 毒感染、 遗传病等方面。 Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ 等 ［ 将 ｓｉＲＮＡ 导入人 的胰腺癌细胞， 特异性地抑制 Ｋ － ＲＡＳＶ１２ 的表达， 使肿瘤的生 长速度及恶性程度降低。对于基因突变引起的难治性遗传病 如舞蹈病、 肌萎缩性侧索硬化症， 通过 ＲＮＡ 干扰技术， 也可达 １７ ］ 到降低突变基因表达， 改善病情的效果。 Ｎｏｖｉｎａ 等 ［ 通过针 对 ＨＩＶ 受体 ＣＤ１４ 和 ＣＣＲ５ 设计 ｓｉＲＮＡ ， 减少受体的表达， 从而 也应用 减少 ＨＩＶ 病毒感染。ＲＮＡｉ 作为新的抗病毒治疗武器， 于脊髓灰 质 炎 病 毒、 呼 吸 道 合 胞 病 毒、 流 感 病 毒 等 研 究 中。 ＲＮＡｉ 的大力发展， 为疾病的治疗提供了新的策略。 ３． ３ 药物开发及应用 近期研究表明， ＲＮＡｉ 还被应用于筛选 ［ １８ ］ 药物及鉴定药物作用靶点。 Ｄｕｆｆ 等 通过 ＲＮＡｉ 技术减少蛋 白转移酶 ９ （ ＰＣＳＫ９ ） 的表达， 发现能有效降低小鼠血清胆固醇 水平， 说明沉默 ＰＣＳＫ９ 可成为治疗高胆固醇的药物靶点。在药 物筛选方 面， 有 研 究 通 过 ｓｈＲＮＡ 发 现 维 甲 酸 类 药 物 能 增 强 １９ ］ ２０ ］ ｐｋ１ １ 激酶抑制剂的抑制作用， 加速癌细胞凋亡 ［ 。 Ｚｈｏｕ 等 ［ 的研究表明， Ａｋｔ 是一种丝 ／ 苏氨酸蛋白激酶， 与胃癌化疗敏感 性有关， 通过 ＲＮＡ 干扰技术将 Ａｋｔ１ 沉默慢病毒转入胃癌细胞 株 ＳＧＣ － ７９０１ 和 ＢＧＣ － ８２３ ， 发现可显著提高对顺铂的敏感性。 ＲＮＡｉ 的应用能明显缩短药物从开发到筛选出最有效药物的时 间， 在药学领域具有不可磨灭的功劳。
１ ＲＮＡ 干扰的发现
ＲＮＡｉ 现象首次发现于植物中。１９９０ 年， Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ 的实验室 为使矮牵牛花的紫色花色加深而在植物中大量引入了同源编码 紫色的基因， 但却开出了白色或斑片状的花朵。这种引入同源 ２］ 基因而致基因表达受抑制的现象在当时被称为共抑制［ 。１９９５ ［ ３］ 年 Ｙｏｕｎｉｓ 等 发现在秀丽新小杆线虫中注射双链 ＲＮＡ 后导致 的基因沉默现象比注射单链正义或反义 ＲＮＡ 更为有效。随后 更多的研究表明， 从线虫到几乎所有真核生物， 包括原生动物， ４－ ６］ 无脊椎动物， 脊椎动物， 真菌和藻类均存在这种现象［ 。这种 引入双链 ＲＮＡ 导致特异性基因沉默的现象被称为“ ＲＮＡ 干扰” 。 后逐渐证实植物中的转录后基因沉默（ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉ ｌｅｎｃｉｎｇ， ＰＴＧＳ） 、 共抑制（ ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ） 及病毒诱发的基因沉默、 真 菌的抑制（ ｑｕｅｌｌｉｎｇ） 现象均属于 ＲＮＡｉ 在不同物种的表现形式。
２ ＲＮＡ 干扰的机制
２． １ ＲＮＡ 干扰过程 ＲＮＡ 干扰过程包括起始阶段和效应阶 ７］ 段［ 。在起始阶段， ｄｓＲＮＡ 在核酸酶（ Ｄｉｃｅｒ 酶） 作用下切割成 ２１ ～ ２３ ｂｐ 双链小分子干扰 ＲＮＡ （ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ ， ｓｉＲ ＮＡ ） ， 在 效 应 阶 段 与 ｓｉＲＮＡ Ａｇｏｈａｕｔｅ ２ 蛋 白 酶 等 结 合， 形成 ＲＮＡ 诱 导 的 沉 默 复 合 物 （ ＲＮＡ －ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ， ＲＩＳＣ ） ， 随后在 ＡＴＰ 提供能量及解旋酶的作用下双链 ｓｉＲＮＡ 解 旋成单 链， 形 成 含 单 链 ｓｉＲＮＡ 的 ＲＩＳＣ ， 又被称为有活性的 ＲＩＳＣ 。活化的 ＲＩＳＣ 与目标 ｍＲＮＡ 分子结合， 抑制基因表达。 同时研究表明 ｓｉＲＮＡ 除了通过上述方式与 ｍＲＮＡ 结合介导转 录后基因沉默外， 还可以通过碱基配对原理， 指导 ＤＮＡ 甲基化 酶结合到 ＤＮＡ 特定部位， 引发该部位 ＤＮＡ 中胞嘧啶的甲基 ８］ 化， 介导转录水平基因沉默 ［ 。ＲＮＡｉ 作为体内的监视系统， 通 过上述两种方式， 积极参与了基因选择性表达过程。 ２． ２ 引发 ＲＮＡ 干扰的小分子来源 引发 ＲＮＡ 干扰的小分子 ＲＮＡ 有多种来源， 主要分为内源性和外源性。内源性干扰小分 子的代表 ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ ， 为一种内源性非编码的 ２１ ～ ２５ ｂｐ 的单 链 ＲＮＡ ， 是首先由细胞核内非编码 ＲＮＡ 在核酸酶的作用下形
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河南医学研究 ２０１５ 年 １ 月第 ２４ 卷第 １ 期 ＨＥＮＡＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｊａｎ． ２０１５ ，Ｖｏｌ． ２４ ，Ｎｏ． １
·综 述·
基因沉默的工具 － ＲＮＡ 干扰技术的研究进展
赵雪萌 余祖江
（ 郑州大学第一附属医院 感染科 河南 郑州 ４５００５２ ） 【 关键词】 基因沉默； ＲＮＡ 干扰； 转录 中图分类号】 Ｒ ３９４ ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００４ － ４３７Ｘ２０１５ ． ０１ ． ０３３ 【 ＲＮＡ 干扰（ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ， ＲＮＡｉ ） 是指与靶基因序列同 源的双链 ＲＮＡ （ ｄｓＲＮＡ ） 所诱导的转录后基因沉默现象， 是真核 生物抵御病毒入侵、 抑制转座子活动、 调控基因表达的监控机 制， 也可替代基因敲除、 核酶、 反义核酸等进行基因沉默相关研 究。众所周知， 基因的表达具有选择性， 我们发现生物体内存 在一套 ＲＮＡ 监视系统， 能通过多种途径产生异常 ｄｓＲＮＡ ， 诱发 ＲＮＡｉ ， 激活抑制基因， 控制活跃基因， 从而参与基因选择性表 达。目前 ＲＮＡｉ 技术因其操作简单、 特异性强、 高效性等特点， 被广泛应用于植物的抗病毒研究、 药物靶基因的筛选、 肿瘤治 １］ 疗等领域 ［ 。现对 ＲＮＡｉ 的进展做一综述。 ｐｒｉ －ｍｉＲＮＡ ） ， 后在 Ｄｒｏｓｈａ 酶的作用下形成含 成前体 ｍｉＲＮＡ （ 有发夹结构的 ｐｒｉ －ｍｉＲＮＡ ， 再在 Ｄｉｃｅｒ 酶作用下形成约 ２２ ｎｔ 的 ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ 。根据其与靶序列配对的程度， 其作用方式包括 两种， 如配对程度高则可以与 ｍＲＮＡ 结合后使目的基因降解， 如配对程度低则可结合 ｍＲＮＡ 的 ３ ’ ＵＴＰ 部位抑制 ｍＲＮＡ 的翻 ９］ 译［ 。众所周 知， 在生物体代谢过程中会产生大量无功能 ＲＮＡ （ ａｂｅｒｒａｎｔ ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｓ ） ， 通过 ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ 的清除或 抑制作用， 在基因水平上发挥了免疫监视功能。 外源性干扰小分子即为 ｓｉＲＮＡ ， 大致有 ３ 种来源： ①可以人 工合成， 包 括 体 外 人 工 合 成 一 对 序 列 互 补 的 单 链 ＲＮＡ （ ｓｓＲ ＮＡ ） ， 导入体内后退火形成 ｄｓＲＮＡ ， 也可通过构建表达 ｄｓＲＮＡ 的质粒， 转入细胞表达 ｄｓＲＮＡ ； ② 可通过 ＲＮＡ 依赖的 ＲＮＡ 聚 合酶（ ＲｄＲｐ ） ， 识别异 常 的 单 链 ＲＮＡ （ 包 括 外 来 ＤＮＡ 产 生 的 ＲＮＡ 、 病毒 ＲＮＡ 等） 并以其为模板合成 ｄｓＲＮＡ 分子； ③ 可以以 干扰过程中 ＲＩＳＣ 剪切产生的 ｓｉＲＮＡ 单链为引物， 以 ｍＲＮＡ 为 模板合成 ｄｓＲＮＡ ， 这种过程被称为随机降解性多聚酶链反应 ［ １０ － １１］ （ ｒａｎｄｏｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ＰＣＲ） ， 是产生 ｓｉＲＮＡ 干扰放大效应 的机制。ｓｉＲＮＡ 干扰本质上就是由 ＲＮＡ 介导的获得性免疫反 应， 是生物体抵抗外来基因的一种保护机制。 ２． ３ ＲＮＡ 干扰的作用特点 ＲＮＡｉ 途径主要存在于细胞浆 中， 与反义核酸、 核酶相比， ＲＮＡｉ 具有以下特点。 ① 特异性。 ｓｉＲＮＡ 是严格按照碱基配对法则与靶 ｍＲＮＡ 结合的， 故只引起 同源 ｍＲＮＡ 的降解。研究表明， 在 ｓｉＲＮＡ ２１ ～ ２３ 个碱基中， 错 配１ ～ ２ 个碱基就会大大降低干扰效应。 ② 遗传性。 ｄｓＲＮＡ 分 子可扩散至生物体各个细胞， 干扰效应可遗传给后代。研究表 明， 通过注射或浸泡 ｓｉＲＮＡ ， 在二代线虫中仍可观察到对靶基 １２ ］ 因的抑制作用 ［ 。但这种遗传效应可持续几代以及高等细胞 中是否也存在上诉现象尚不明确。 ③ 位置效应。研究表明只 有针对编 码 区 的 ｄｓＲＮＡ 才 产 生 干 扰 效 应， 对内含子区域的 １３ ］ １４ ］ ｄｓＲＮＡ 不产生干扰效应 ［ 。Ｋｅｓｈａｒｗａｎｉ 等 ［ 根据人组织因子 （ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ， ｈＴＦ ） 的不同位置合成了四组双链 ＲＮＡ 分 别观察其干 扰 效 应， 结 果 显 示 ｈＴＦ１６７Ｉ 和 ｈＴＦ３７２Ｉ 有 ８５ ％ ～ ９０％的基因沉默效率， ｈＴＦ５６２Ｉ 只能抑制部分基因， ｈＴＦ４７８Ｉ 几 乎无干扰效应。④放大效应。通过实验研究发现， 少量 ｄｓＲＮＡ 就能够使大量目的基因沉默， 即使细胞增殖 ５０ ～１００ 倍， 这种 沉默现象仍然存在， 表明 ＲＮＡｉ 存在扩增机制。
３ ＲＮＡ 干扰的应用
３． １ 基因研究新工具 通过 ＲＮＡｉ 特异性抑制目的基因表达， 从而了解该基因的功能， 扩展基因文库， 是 ＲＮＡ 干扰技术开展 １５ ］ 后最开始的应用方向。 Ｙｕ 等 ［ 通过构建 ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 的 ｓｉＲＮＡ 表达质粒， 抑制 ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 基因的表达， 研究该基因对瘢痕疙瘩 成纤维细胞的细胞增殖和细胞周期变化。同时 ＲＮＡ 干扰在信 号传导通路的研究进展中功不可没。通过利用 ＲＮＡ 干扰技术 进行基因组功能的分析可迅速建立基因与表型的关系， 大大缩