生物化学实验

生物化学实验讲义

化学工程与技术学院

基础部

实验一酪蛋白得制备

一、目得

学习从牛乳中制备酪蛋白得原理与方法。

二、原理 .

牛乳中主要得蛋白质就是酪蛋白,含量约为35g/L。酪蛋白就是一些含磷蛋白质得混合物,等电点为4、7。利用等电点时溶解度最低得原理,将牛乳得pH调至4、7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。

三、器材

1 、离心机 2、.抽滤装置

3、精密pH试纸或酸度计

4、电炉

5、烧杯

6、温度计 .

四、试剂与材料

1、牛奶 2500mL

2、95％乙醇 1200mL

3、无水乙醚 1200mL

4、0、2mol／L pH 4、7醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL

5、.乙醇—乙醚混合液2000mL

五、操作

1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预

热至40℃、pH 4、7得醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4、7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液,得酪蛋白粗制品。

2、 用水洗沉淀3次,离心10分钟(3000r ／min),弃

去上清液。

3、 在沉淀中加入30mL 乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊

液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉

淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。

4、 将沉淀摊开在表面皿上,风干;得酪蛋白纯晶。

5、 准确称重,计算含量与得率。

含量:酪蛋白g ／100mL 牛乳(g ％)

得率:%100 理论含量

测得含量 思考题

1、制备高产率纯酪蛋白得关键就是什么？

实验二 小麦萌发前

后淀粉酶活力得比较

一、目得

1、学习分光光度计得原理与使用方法。

2、学习测定淀粉酶活力得方法。

3、了解小麦萌发前后淀粉酶活力得变化。

二、原理

种子中贮藏得糖类主要以淀粉得形式存在。淀粉酶

能使淀粉分解为麦芽糖。

2(C 6H 10O 5)n +nH 2O

nC 12H 22O 11

麦芽糖有还原性,能使3,5---二硝基水杨酸还原成

棕色得3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测

定。

OH COOH NO 2O 2N OH

COOH

O 2N NH 2

3,5 —二硝基水杨酸还原反应

（棕色） 休眠种子得淀粉酶活力很弱,种子吸胀萌动后,酶

活力逐渐增强,并随着发芽天数增加而增加。

本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力得变化。

三、器材

1、25mL刻度试管

2、吸管

3、离心管

4、乳钵

5、分光光度计

6、恒温水浴

7、离心机

四、试剂与材料

1、小麦种子

2、o、1％标准麦芽糖溶液

精确称量100mg麦芽糖,用少量水溶解后,移入100mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度。

3、pH6、9,0、02mol/L磷酸缓冲液

0、2mol/L磷酸二氢钾67、5mL与0、2mol/L 磷酸氢二钾82、5混合,稀释10倍。

4、1％淀粉溶液

1g可溶性淀粉溶于100mL0、02mol/L磷酸缓冲液中,其中含有0、0067mol/L氯化钠。

5、1％3,5—二硝基水杨酸试剂

将1、00g3,5—二硝基水扬酸溶于20ml 2M L1NaOH 溶液与50ml水中,加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。

6、1％氯化钠溶液

五、实验操作

1、种子发芽小麦种子浸泡

2、5小时后,放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。

2、酶液提取取发芽第3或第4天得幼苗15株,放入乳钵内,加入1%氯化钠溶液10mL,用力磨碎。在室温下放置20分钟,搅拌几次。然后将提取液离心(1500r/min)6—7分钟。将上清液倒人量筒,测定酶提取液得总体积。进行酶活力测定时,用缓冲液将发芽第3或第4天得幼

苗稀释10倍。

取干燥种子15粒作对照(提取步骤同上)。

3、酶活力测定

(1)取25mL刻度试管4支,编号。按下表要求加入各试剂(各试剂须在25℃预热10分钟)

将各管混匀,放在25℃水浴中,保温3分钟后,立即向各管加入1％3,5—二硝基水杨酸溶液2mL。

(2)取出各试管,放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温,加水稀释至25mL。并混匀。在A500nm处测定各管得吸光度。

4、计算

根据溶液得浓度与光吸收值成正比得关

系,标准标准酶酶A C A C ⨯=

本实验规定:25℃时3min 内水解淀粉释放1mg 麦芽

糖所需得酶量为1个酶活力单位(u)。酶活力计算公式为:酶酶酶酶活力n V C ⨯⨯=

式中:C 酶 酶液麦芽糖得浓度,V 酶 提取酶液得总体积,n 酶酶液稀释倍数。

思考题

1、 为什么此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？

而测酶得活力时要在25预保温？反应后又放入沸水

浴中？

2、 实验结果说明什么？

实验三 纸层析法分离鉴定氨基酸

一、目得

通过氨基酸得分离,学习纸层析法得基本原理及操作方法。

二、原理

纸层析法就是用滤纸作为惰性支持物得分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂与水组成。

物质被分离后在纸层析图谱上得位置就是用R f 值(比移)

来表示得: …

R f ==原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距在一定得条件下某种物质得只R 值就是常数。R f 析温度等因素有关。法分离氨基酸。

三、器材

1、层析缸

2、毛细管

3、喷雾器

4、培养皿

5、层析点原点