荧光分析法

3 2 1 V＝0
吸光
无辐射跃迁
3 2 1 V＝0
无辐射跃迁
吸光
荧光
3 2 1 V＝0
荧光的产生
蒽结晶体或乙醇溶液吸收 366nm 紫外光， 产生青紫色的荧光。
激发单重态
荧光
基态
（二）分子荧光的分类
• 紫外-可见光荧光 • X射线荧光 • 红外光荧光
二、荧光激发光谱(Excitation spectrum) 和荧光发射光谱(fluorescence spectrum)
使荧光效率提高；吸电子取代基，如－COOH、
NO2等使荧光减弱。
3. 荧光试剂
• 大部分化合物由于不吸收紫外光或荧光效率低 而不发生荧光或荧光很弱； • 为了提高荧光分析法的灵敏度、选择性，扩大 荧光分析的范围，研究了一类试剂，它们一些 化合物反应能生成强荧光性产物； • 常见的荧光试剂有：
– 荧光胺 能与脂肪胺或芳香胺生成强荧光物；
检测器
荧光分光光度计的结构示意图
I0
Il
F
溶液的荧光测定
• 激发光谱的测定 扫描激发单色器（发射单 色器固定在较长的波长）。 • 荧光光谱的测定 激发单色器固定在最大吸 收波长，扫描发射单色器。 • 定量分析条件的确定 最大激发波长和产生 的最大荧光波长（最灵敏的条件）。
二、荧光分析新技术
• 激光荧光分析 以激光作为光源，大大提高分析 的灵敏度和选择性； • 时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不 同，在激发和监测之间的延缓时间不同分别检测；
ex 205 nm em 278 nm 0.11
286 nm 321 nm 0.29
Байду номын сангаас
356 nm 404 nm 0.36
• 刚性平面结构的分子有较高的荧光效率； 例如，萘和维生素A都有5个双键，但萘的荧光 强度是维生素A的5倍。
CH 2 OH

0.2
1.0
• 共轭体系上的取代基不同对荧光效率的影响不 同。给电子取代基，如－NH2、OH、－OR等
• 荧光激发光谱: 荧光强度（F）对激发光波长 （ex）所作的图，形状与吸收光谱极为相似。
• 荧光发射光谱（简称荧光光谱）：以荧光强 度（F）对荧光波长（em）所绘的曲线。 • 激发光谱有时有几个谱带；荧光光谱只有一个 谱带，其形状与激发光波长无关。
蒽乙醇溶液的荧光激发光谱（虚线）和发射光谱
三、荧光和分子结构的关系
– 邻苯二甲醛（OPA） 能与－氨基酸等形成灵敏的 荧光产物
– 测定无机离子的荧光试剂
四、影响荧光强度的外部因素
• 温度 • 溶剂
• 酸度
• 荧光熄灭剂
• 散射光
1. 温度的影响
–随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在 0℃以下，每降10℃荧光效率增加3％。-80 ℃ 时达到100％。
–原因是温度升高，分子运动速度加快，碰撞 机率增加，使无辐射跃迁增加，因而降低了 荧光； –采用低温荧光测定技术，可大大提高灵敏度。
• 同步扫描荧光法 发射单色器与激发单色器的波 长差保持固定，两者同时扫描，得到宽度很窄的 谱峰，可用于混合物定性分析； • 胶束增敏荧光分析 利用表面活性剂在水中形成 的胶束对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用提高 分析的灵敏度和稳定性。
第三节 荧光定量分析方法
1. 荧光强度与物质浓度的关系
F 2 . 3 I 0 cl
1.发生荧光的条件 • 物质能吸收紫外或可见光用于激发。 • 物质具有较高的荧光效率。
荧光效率
＝
发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
有些物质分子通过无辐射形式回到基态， 荧光效率为 零，不产生荧光。
2.有机化合物结构与荧光的关系
• 大的π 电子共轭体系 共轭体系愈大，荧光 强度愈大，荧光波长红移。例：
2. 溶剂的影响
–极性 溶剂极性增加，物质荧光强度增加， 波长红移；其原因是在极性溶剂中*的 能量减小，机率增大；
8-巯基喹啉在不同溶剂中的荧光波长和荧光效率 介电常数 荧光峰（nm） 荧光效率
乙腈 丙酮 氯仿 四氯化碳
38.8 21.5 5.2 2.24
410 405 398 390
0.064 0.055 0.041 0.002
5. 散射光
–散射光 光子与分子碰撞，使光子的运动方向改 变而向不同角度散射； –瑞利散射光 光子与分子发生弹性碰撞时产生的 散射光。由于弹性碰撞不发生能量交换，瑞利散 射光的波长与入射光相同； –拉曼散射光 光子与分子发生非弹性碰撞时产生 的散射光。此时，光子与分子有能量交换，所以 拉曼光的波长比入射光稍长或稍短。
荧光分析法
一、什么是荧光
物质吸收紫外光（或可见光）后，发出各种 颜色和强度的可见光 -- 荧光。 X-光荧光、红外光荧光 二、荧光的用途
工农业生产、科研和日常生活。
物质的定性、定量分析 -- 荧光分析。
第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家
N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，
4.方法快速简便，重现性好。
5.可用作HPLC的检测器，或与薄层、纸层等联 用。
应用实例
• 维生素B2的测定：
激发光波长：430～440nm；
发射光波长：535nm。 pH6～7时荧光强度最大，pH约11时荧光消失。 • 利血平片含量的测定（中国药典）：
供试样品和对照品溶液加五氧化二钒试液，剧 烈振摇后，30℃放置1小时，在激发光波长 400nm；发射光波长500nm处读取荧光强度， 采用比例法计算含量。
制荧光强度－浓度的工作曲线。
• 比例法
F s F0 F x F0

Cs Cx
• 联立方程法 利用荧光强度的加和性对多 组分混合物进行同时测定。
三、荧光分析法的优点
1.灵敏度高。可检测10-10～10-12g/ml,
2.有机物分析选择性高。受激发光波长和荧光 波长两个条件的制约。 3.应用范围广。不发生荧光的物质可通过适当 的反应生成强荧光物质，然后分析。
应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光的产生与分类
（一）分子荧光的产生 （1）基态分子吸收光能，跃迁到电子激发态的 各个不同振动能级。 （2）处于高能态的分子通过无辐射跃迁，降落 到第一电子激发态的最低振动能级。 （3）分子从第一电子激发态的最低振动能级, 降落到电子基态的各个振动能级，发射出荧光。
第二节 荧光分光光度计和 荧光分析新技术
一、荧光分析计
1. 基本部件
• 光源 产生强度一致的紫外和可见光，一般用 氙灯（250～700nm）；
• 单色器 • 样品池 • 检测器 两个,分别用于激发和发射光的分光； 石英制； 光电池或光电管。
光源
激发单色器
样品池
发 射 单 色 器 指示器 放大器 记录仪
F -- 荧光强度，
ε -- 摩尔吸光系数， φ -- 荧光效率，
I0 --入射光强度， C -- 溶液浓度， L -- 光程（液槽厚度）
• 当溶液浓度很稀(ε c L ≤ 0.05)时， F ∝ C ；
2. 定量分析方法
• 荧光定量分析的基本方法与紫外类似；
• 校正曲线法
测定已知浓度的标准溶液，绘
四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与 荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。
• 影响荧光强度的主要因素 是波长比入射 光较长的拉曼散射光。因为物质发射的荧 光波长比激发光（即入射光）波长长。
• 消除溶剂拉曼光干扰的方法： - 选择合适的溶剂
- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动 如硫酸奎宁的测定
常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长
激发光 溶剂拉曼光波长 波长 水 乙醇 环己烷 四氯化碳 248 271 267 267 － 313 350 344 344 320 365 416 405 408 375 405 469 459 458 418 436 511 500 499 450
氯仿 － 346 410 461 502
– 黏度 荧光强度随溶剂黏度减少而降低， 因为黏度降低分子运动加快，碰撞使无辐射 跃迁加大。
3. 溶液pH的影响 对弱酸或弱碱类荧光物质影响大，因为pH
影响其离子或电子结构，从而影响荧光发生。
4. 荧光熄灭剂
–荧光熄灭 荧光物质与溶剂或其他溶质作 用引起荧光强度下降的现象； –荧光熄灭剂(quenching medium) 引起荧 光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、 氧分子和硝基化合物是常见的熄灭剂。 –荧光熄灭法(fluorescence quenching method) 利用荧光强度与荧光熄灭剂的浓 度呈线性关系来测定荧光熄灭剂含量的方法