耐药细胞株构建 - 360文档中心

耐药株构建问题回答

耐药株构建
耐药株构建是一种常见的实验方法，它可以用于研究细菌的耐药性和
抗菌药物的作用机制。

在构建耐药株的过程中，研究人员通常会利用
基因工程技术或者化学物质来改变细菌的基因组或者代谢途径，从而
使其对抗菌药物产生耐药性。

构建耐药株的方法有很多种，其中最常见的方法是利用基因工程技术。

这种方法通常需要先将目标基因克隆到一个载体中，然后将载体导入
到细菌中。

在细菌中，目标基因会被表达出来，并且对细菌的代谢途
径或者细胞壁结构产生影响，从而使细菌对抗菌药物产生耐药性。

除了基因工程技术，化学物质也可以用于构建耐药株。

例如，一些化
学物质可以抑制细菌的代谢途径或者细胞壁合成，从而使细菌对抗菌
药物产生耐药性。

这种方法通常比基因工程技术更简单，但是也更加
不可控，因为化学物质可能会对细菌产生不良影响，导致细菌的生长
受到抑制。

构建耐药株的应用非常广泛，它可以用于研究抗菌药物的作用机制，
评估新型抗菌药物的疗效，以及探究细菌的耐药性机制。

例如，研究
人员可以利用构建耐药株的方法来研究青霉素对链球菌的作用机制，
或者评估新型抗菌药物对金黄色葡萄球菌的疗效。

总之，构建耐药株是一种非常有用的实验方法，它可以用于研究细菌的耐药性和抗菌药物的作用机制。

在构建耐药株的过程中，研究人员需要注意安全问题，并且选择合适的方法和实验条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。

耐药细胞株构建实验

耐药细胞株构建实验
实验目的：采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对药物产生耐药性
实验材料：
试剂：培养基（GIBCO），血清（CIBCO）
仪器：超净工作台、CO 2培养箱、生物倒置显微镜
实验内容与方法：
1.体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导细胞的耐药性
2.MTT法测定药物对亲本细胞和耐药细胞的IC50，计算耐药指数
实验信息：
1．生长状况良好的亲本细胞株，并提供细胞特性，培养条件及相关注意事项。

2．诱导剂
服务周期：6个月
结果提交：提交实验报告书（耐药指数、实验试剂与设备、实验过程、结果分析、原始数据、细胞图片等）、耐药细胞株、亲本细胞株[晶莱生物]。

耐药细胞株构建步骤

耐药细胞株构建步骤
构建耐药细胞株的步骤通常包括以下几个步骤：
1.选择合适的抗生素或药物：首先需要确定要构建的耐药细胞
株所需要具备的耐药性。

根据目标抗生素或药物的类型和机制，选择适用的耐药基因或耐药突变体。

2.导入耐药基因或耐药突变体：可以通过转染、电转化或基因
敲入等方法将耐药基因或耐药突变体导入到目标细胞内。

转染方法通常包括化学转染、病毒转染或电穿孔等。

3.筛选并扩增耐药细胞：转染后，将细胞培养在含有目标抗生
素或药物的培养基中，筛选出对抗生素或药物具有耐药性的细胞。

4.确认耐药细胞株：对筛选出的耐药细胞进行进一步验证，例
如通过基因检测、检测细胞对目标药物的生长抑制程度或分子靶点的表达水平等方法，确认细胞株确实具备所需的耐药性。

5.保存和维护耐药细胞株：将经验证的耐药细胞株保存并维护
在适当的条件下，以备后续实验或应用。

不同实验室和研究领域可能存在一些细微的差别和特定的步骤，但以上步骤是构建耐药细胞株的基本流程。

体内耐药细胞株构建实验的具体方法及步骤

体内耐药细胞株的建立实验的具体方法及步骤
细胞与低剂量的药物长期接触，引起细胞本身药物化学过程的改变，细胞膜上出现P gp糖蛋白，使细胞逐渐对药物耐受，随着药物浓度的递增，其耐受程度逐渐加强。

一、材料准备
1. 动物选择：根据欲建立的耐药细胞株，选择合适的动物。

在实验期间，一般选择同性别动物进行实验，动物体重的选择以雌性约17~21 g，雄性约18~22 g 为宜。

2. 瘤株的选择：常见的瘤株均可，应依据研究目的、方向确定实验用瘤株，考虑到传代方便，且容易观察或检测，多选择腹水性肿瘤。

二、实验步骤
1. 所试药物的毒性测定
（1）把小鼠随机分成5~8组，每组10~20只小鼠，每只动物每天给予定量的药物，每天1次，连续给药5天，然后观察30天。

（2）记录30天内动物的死亡数。

药物的剂量应能使动物的死亡率从0~100%。

（3）计算LD10及95%的可信限，耐药株建立的最初剂量约为1/6LD10。

2. 瘤细胞生长测定
（1）用传代第7天的腹水癌细胞给每只动物接种15×106个细胞，7天后处死动物，开腹，收集全部腹水，腹腔用含150 IU的肝素生理盐水冲洗3次。

（2）合并腹水及冲洗液进行瘤细胞计数，腹水5 500 g 离心5 min，测定瘤细胞压缩体积。

（3）统计不同剂量用药组及对照组的瘤细胞压缩体积，可以测出药物对肿瘤细胞生长的
影响。

（4）药物剂量一般在LD10时，能完全抑制敏感株肿瘤细胞的生长。

耐药胞株构建

稳定/耐药细胞株构建一、服务介绍稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。

稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。

本公司可提供普通脂质体转染后单克隆法筛选,以及病毒感染后筛选稳定株和耐药株二、技术原理稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。

稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。

用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。

在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。

常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）三、操作流程1、载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。

2、筛选浓度测定：以14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。

3、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定4、细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。

5、抗生素筛选。

6、鉴定筛选结果四、客户提供1.外源基因及相关基础数据；2.生长状态良好的靶细胞系,特殊细胞需提供培养基3.与该技术相关其它信息五、实验结果提供形式1、构建完成的稳定/耐药细胞株以及对照细胞株2、稳转/耐药细胞株标准实验报告及相关的外源基因表达分析结果3、实验流程及报告电子版本一份六、实验服务周期约5-8周左右，具体时间根据细胞生长,药物诱导情况而定。

七、质量承诺及舜百优势a.稳定：舜百生物保证20代以内稳定转染细胞稳定表达。

b.迅速：一般控制在1.5个月以内完成构建。

c.经济：价格实惠，性价比高。

d.质量保证：对外源基因进行严格鉴定。

人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制的探讨

人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性李文静1，张磊2，赖娅娜2，唐金海3，钟山亮1，恽文3，赵建华1(210009 江苏南京，南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3)[摘要] 目的建立人乳腺癌多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）耐药细胞模型MCF-7/Doc，初步探讨其生物学特性。

方法采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株；通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT 法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性；实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。

结果经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株，可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长，耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍，对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。

光镜下，药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少；MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长（41.6h vs 30.6h；P<0.01）。

与亲代相比，耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少；MDR1基因表达水平增高90.7倍，蛋白表达转为阳性，而雌激素受体阳性表达丢失。

结论MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性，MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。

[关键词] 乳腺癌细胞；多西紫杉醇；多药耐药；P糖蛋白[中图分类号] R737.9乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一；然而多药耐药（multi-drug resistance, MDR）常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。

多西紫杉醇（Doc）是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上，经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物，溶解性好，药效更优。

临床实践表明，以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1]，但耐药问题也不容忽视，据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为[基金项目]江苏省社会发展科技计划项目（BS），国家自然科学基金资助项目（）第一作者：李文静，女，硕士研究生，主要方向：临床检验诊断学，电话：，E-mail：通讯作者：赵建华，女，硕士生导师，研究员，主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究：电话：, E-mail：30-50%[2]。

耐药株的构建

耐药株的构建
耐药株的构建是指通过实验手段使某一细菌株对特定抗生素或药物产生耐药性。

耐药株的构建可以通过以下几种方法实现：
1. 随机突变：将细菌株暴露在高浓度抗生素或药物的环境中，使其突变，产生对该药物的耐药性。

这种方法通常需要大量试验和筛选。

2. 基因转移：利用细菌之间的水平基因转移机制，将耐药基因从其他细菌株或质粒转移到目标细菌中。

这种方法更快速，能够直接获得耐药特性，但需要具备耐药基因的源细菌或质粒。

3. 基因工程：利用分子生物学技术将已知的耐药基因或耐药相关基因导入目标细菌中，使其表达耐药特性。

这种方法相对精准，可根据需要选择特定的耐药基因。

耐药株的构建是为了研究细菌耐药性的机制以及开发新的抗生素或药物对策。

然而，需要注意的是，耐药株的构建应在严格的实验条件下进行，避免耐药基因在环境中的传播，以免对人类和动物健康产生潜在风险。

耐药株构建

耐药株构建介绍耐药株构建是一种通过实验室技术使细菌、真菌等病原微生物对特定药物产生抗药性的过程。

这种技术可以帮助科研人员研究和了解耐药性的形成机制，以及开发新的药物来对抗耐药菌株。

耐药性的产生原因耐药株的产生是由于基因突变和基因水平的表达变化。

以下是几个常见的耐药机制：基因突变在微生物的基因组中，突变是一种相对常见的现象。

细菌和真菌的基因组在繁殖过程中会发生变异。

某些突变可能导致特定基因的表达变化，从而产生抗药性。

例如，DNA修复酶突变可能导致细菌对DNA损伤型药物具有抗药性。

基因表达变化耐药性也可以通过基因表达的变化获得。

某些微生物可以通过改变特定基因的表达水平来适应环境压力。

例如，抗生素通过抑制微生物的蛋白合成来起到杀菌作用，但耐药株可以通过增加药物泵的表达量来有效排出抗生素。

耐药株构建的实验方法在实验室中，有许多方法可以构建耐药株。

以下是一些常用的技术：驯化通过多次繁殖耐药株，可以逐渐增加细菌或真菌对特定药物的抗药性。

这称为驯化。

驯化方法通常包括循环曝露菌株于递增剂量的药物，并选择具有较高抗药性的个体进行进一步繁殖。

基因工程利用基因工程技术，科研人员可以向微生物细胞中引入特定的耐药基因。

这些基因可以来自其他细菌或真菌，通过转化技术将它们导入目标微生物中。

这种方法可以在原始菌株中引入新的耐药性。

耐药基因启动有时，微生物自身已经具有某种潜在的耐药基因，但该基因未表达。

通过人为创造特定的条件，可以促使该基因的表达并使微生物对药物具有抗药性。

例如，通过在培养基中添加抗生素可以选择性地诱导耐药基因的表达。

重要性和应用领域耐药株构建在研究和临床实践中具有重要意义。

抗药性机制研究构建耐药株可以帮助科研人员深入了解耐药机制。

通过对比抗药株和敏感菌株的基因组和基因表达差异，可以找到耐药性的关键因素。

这些研究有助于发现新的靶点和开发新的药物来对抗耐药菌株。

特定药物研究耐药株的构建可以帮助研究人员评估药物的有效性。

耐药细胞株构建实验

耐药细胞株构建实验
实验目的：采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对药物产生耐药性
实验材料：
试剂：培养基（GIBCO），血清（CIBCO）
仪器：超净工作台、CO 2培养箱、生物倒置显微镜
实验内容与方法：
1.体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导细胞的耐药性
2.MTT法测定药物对亲本细胞和耐药细胞的IC50，计算耐药指数
实验信息：
1．生长状况良好的亲本细胞株，并提供细胞特性，培养条件及相关注意事项。

2．诱导剂
服务周期：6个月
结果提交：提交实验报告书（耐药指数、实验试剂与设备、实验过程、结果分析、原始数据、细胞图片等）、耐药细胞株、亲本细胞株[晶莱生物]。

胃肠道间质瘤伊马替尼耐药细胞株的建立及细胞凋亡的实验研究

ＧｕＢｉｎｂｉｎ，ＹｅＬｉｐｉｎｇ，ＦａｎｇＣｏｎ —
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＡｐｏｔｏｓｉｓｏｆａｎＩｍａｔｉｎｉｂＲｅｓｉｓｔａｎｔＣｅｌｌＬｉｎｅｏｆＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＳｔｒｏｍａｌＴｕｍｏｒ．
采用首剂大剂量冲击和逐
步增加剂量相结合的方法诱导胃肠道间质瘤细胞ＧＩＳＴ一８８２对Ｉｍａｔｉｎｉｂ耐药，建立耐药细胞株，ＣＣＫ８法绘制细胞生长曲线，计
算细胞的倍增时间及半抑制浓度Ｉｃ流式细胞仪检测ＧＩＳＴ一８８２及耐药株ＧＩＳＴ一８８２一ＩＭ细胞凋亡及细胞周期。结果耐药
ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ，ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅａｎｄＩＣ５０ｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙＣＣＫ一８ａｓｓａｙ．ＴｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆＧＩＳＴ一８８２、ＧＩＳＴ一８８２一ＩＭｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｌｏｆｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅｏｆＧＩＳＴ一８８２一ＩＭａｎｄＧＩＳＴ一８８２ｗａｓ５８．９５ ± １．５６ｈａｎｄ４９．４９ ±０．６９ｈ

鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究

鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究随着乳腺癌发病率的不断增加，对乳腺癌的治疗变得尤为重要。

然而，乳腺癌的多药耐药问题成为制约治疗效果的主要因素之一。

为了更好地研究乳腺癌多药耐药的机制，本文通过建立鼠源乳腺癌多药耐药细胞株，并对其耐药机制进行初步研究，为乳腺癌的治疗提供理论依据。

一、实验方法1. 细胞培养本研究选取鼠源乳腺癌细胞株，通过传代培养，使细胞系稳定生长，并分为两组：药物敏感组和药物耐药组。

2. 耐药细胞株的建立在药物敏感组细胞培养过程中，逐渐增加药物的浓度，直至细胞对该药物表现出较强耐药性。

通过持续这种培养方式，最终得到鼠源乳腺癌多药耐药细胞株。

3. 细胞生存能力检测药物敏感组和耐药组细胞分别接受一定剂量的不同药物处理，使用MTT法检测细胞的生存能力，并比较两组细胞的差异。

4. 基因表达分析利用实时荧光定量PCR技术对药物敏感组和耐药组细胞的耐药相关基因进行检测，并分析其表达水平的变化。

二、结果与讨论1. 耐药细胞株的建立经过长期培养选择，成功建立了鼠源乳腺癌多药耐药细胞株。

与药物敏感组细胞相比，耐药组细胞对多种常用药物表现出明显的耐药性。

2. 细胞生存能力检测通过MTT法检测药物敏感组和耐药组细胞的生存能力，结果显示耐药组细胞对药物的抑制能力明显降低，生存能力较高。

3. 基因表达分析药物敏感组和耐药组细胞的基因表达水平存在明显差异。

通过实时荧光定量PCR技术检测了耐药相关基因，结果显示这些基因在耐药组细胞中表达水平明显上调，与药物敏感组细胞相比差异显著。

综上所述，通过建立鼠源乳腺癌多药耐药细胞株并进行初步研究，我们初步认识到耐药机制与某些基因的过度表达密切相关。

然而，耐药机制的具体细节仍需进一步研究。

希望本研究能为乳腺癌的治疗提供新的思路和方向，为寻找新的治疗方法奠定基础。

尽管本研究取得了一定的进展，但由于实验条件有限，研究结果尚需进一步验证和完善。

未来的研究可以结合更多的实验方法和手段，开展更深入的研究，以期能够揭示乳腺癌多药耐药机制的更多细节，并为临床治疗提供更精准的指导。

一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法[发明专利]

专利名称：一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法专利类型：发明专利
发明人：许爱华,曹晨洁,顾云浩,胡碧原,王俊,韩东冬,苏雅,许奕,陈华圣
申请号：CN201510379598.4
申请日：20150701
公开号：CN104928249A
公开日：
20150923
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种小鼠肉瘤180多药耐药细胞株的体内构建方法，属于生物医学技术领域。

选用顺铂、氟尿嘧啶和环磷酰胺三种药物体内给药并逐渐增加剂量诱导S180腹水瘤小鼠，成功构建了S180多药耐药细胞株，对阿霉素具有交叉耐药性，耐药强度较高，耐药稳定时间较长。

本发明为研究肿瘤多药耐药机制、筛选各类抗肿瘤药物、研发包括中药或天然药物类在内的肿瘤耐药逆转药物提供了小鼠肿瘤多药耐药细胞株与动物模型，具有很好的应用前景。

申请人：扬州大学
地址：225000 江苏省扬州市大学南路88号
国籍：CN
代理机构：扬州苏中专利事务所(普通合伙)
代理人：许必元
更多信息请下载全文后查看。

鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究

鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究目的构建鼠源性乳腺癌5-氟尿嘧啶（5-Fu）耐药细胞株，为研究乳腺癌耐药与体内免疫微环境的关系提供细胞模型。

方法通过体外以浓度递增的方法诱导小鼠乳腺癌4T1细胞对5-Fu产生耐药，MTS法确定其耐药性，平板克隆检测其增殖活性，实时定量和半定量PCR检测其中5-Fu代谢相关酶TS、MTHFR、TK、OPRT、DPD及药泵蛋白MDR1、MRP1的表达，通过流式细胞术检测其周期及CD44+CD24-干细胞亚群的比例。

结果耐药细胞4T1/5-Fu与4T1细胞相比，4T1/5-Fu细胞对5-Fu、吉西他滨和顺铂耐药的耐药指数（RI）明显升高；5-Fu合成代谢相关酶TK、OPRT表达明显降低（P < 0.05），代谢抑制性相关酶TS、MTHFR明显升高（P < 0.05），药泵蛋白MDR1、MRP1表达明显升高（P < 0.05）；流式细胞术结果显示，CD44表达明显升高，肿瘤干细胞群增多。

结论成功构建小鼠乳腺癌多药耐药细胞株，耐药发生可能与5-Fu代谢酶类、药泵蛋白表达以及干细胞比例改变相关。

[Abstract] Objective To construct 5-fluorouracil （5-Fu）resistant murine breast cancer cell line，in order to provide cell model for study of relationship between breast cancer multidrug resistant and immune microenvironment in vitro. Methods 4T1 cells were exposed in stepwise escalatingconcentration of 5-Fu to develop the resistant cell line 4T1/5-Fu. And the chemosensitivity and proliferation of 4T1/5-Fu were determined by MTS and colony forming experiments，respectively. Furthermore，real-time RT-PCR and semi quantitative PCR were used to measure expression levels of 5-Fu related genes，such as TS，MTHFR，TK，OPRT，DPD，MDR1，MRP1. In addition，cell cycle and the proportion of CD44+CD24- stem cell subsets were evaluated by flow cytometry. Results Comparing to 4T1 cells，the resistance index of 4T1/5-Fu cells to 5-Fu，GEM，cDDP was increased. The results showed that compared with 4T1 cells，the expression levels of TK and OPRT were significantly decreased （P < 0.05），while TS，MTHFR，MDR1 and MRP1 were remarkably increased in 4T1/5-Fu cells （P < 0.05）. Flow cytometry assay showed that the propotion of tumor stem cells CD44+CD24- was evidently increased in 4T1/5-Fu cells than that of 4T1 cells. Conclusion This article has successfully constructed multidrug resistant cell line 4T1/5-Fu，whose resistance may be associated with up-regulation of the 5-Fu metabolic enzymes，drug pump proteins expression and tumor stem cells percentage change.[Key words] Tumor resistance；4T1 cell；5- fluorouracil；Tumor stem cells乳腺癌是严重危害女性健康和生命的重大疾病，化学治疗是乳腺癌综合治疗中不可或缺的治疗方法，而不可避免的化疗耐受是严重影响乳腺癌治疗效果的瓶颈问题。