维生素 D说明书

-4.3% 2.5% 4.7% -4.4%
C. 精密度
检测精密度是经过长达 20 天，通过检测 3 个不同批号的产品而得出的。结果总结如下表所示：
批内
批间
样品
N
<X> ± SD
C.V.
样品
N
<X> ± SD C.V.
(ng/ml)
(%)
(ng/ml)
(%)
A
24
5.5 ± 0.4
7.8
A
39
17.7 ± 1.3
B. 试验步骤 1． 选择所需数量的微孔进行试验。未使用的微孔应放回有干燥剂的包装袋中封好，储存在于 2-8℃。 2． 将微孔安装到固定架上。 3． 加入 50μ l 的标准品，质控和样品到对应的微孔中。 4． 加入 150μ l 孵育缓冲液到所有的微孔中，充分混匀。 5． 室温下，在平板振荡器（300〜700 转/分钟）上孵育 2 小时，在孵育过程中，且至少使用前 1 小时 45
5瓶; 冻干品 黄色
质控品 N=2, 含有proclin的人血清
2瓶; 冻干品 银色
孵育缓冲液：含有干酪素和proclin
1瓶; 20ml
绿色
25-羟基维生素D的浓缩结合物
1瓶;0.4ml
蓝色
含有干酪素和proclin的结合物缓冲液
1瓶;30ml
红色
加入2ml蒸馏水 加入1ml蒸馏水
加入1ml蒸馏水 备用 用结合物缓冲液稀释100倍 备用
四．方法学原理:
该试剂是一个在微孔板上进行的酶联免疫试验。第一阶段，室温孵育2小时，校准品，质控品和样品 中的25-羟基维生素D(D2和 D3 ) 脱离结合的血清蛋白,并与特异性的单克隆抗体结合。洗板后加入辣根过 氧化物酶（HRP），室温下孵育30分钟。孵育过程中生物素标记的25-羟基维生素D与未标记的25-羟基维生 素D2和D3竞争单克隆抗体上的结合位点。洗板后，加入显色溶液（TMB）孵育15分钟。最后加入终止液停 止反应并在适当的波长下读取吸光度。底物的量是通过测量吸光度来决定的，吸光度值与25-羟基维生素D （D2和D3）的浓度成反比。
浓缩辣根过氧化物酶溶液
1瓶;0.2ml
黄色
洗液 (TRIS-HCL)
1瓶;10ml
棕色
TMB显色液
1瓶;12ml
棕色
终止液: 1mol/L的盐酸
1瓶;12ml
注意：使用校准品0来稀释比最高值校准品的值高的样品。 没有可用的国际参考材料。
六．自备材料:
以下是必需的但试剂盒中不提供的材料： 1. 蒸馏水 2. 50μ l，150μ l，200μ L和1ml加样器和一次性塑料吸头. 3. 旋涡振荡器 4. 磁力搅拌器 5. 平板振动器（300至700 转/分钟） 6. 洗板机 7. 酶标仪, 使用波长450 nm和650nm（双波长读取）
准备好的辣根过氧化物酶结合物工作液是不稳定的，没有使用的剩余工作液应丢弃。
使用条数
浓缩结合物（uL）
浓缩的辣根过氧化物酶溶液（uL） 结合物缓冲液（mL）
1
30
15
3
2
50
25
5
3
60
30
6
4
80
40
8
5
90
45
9
6
100
50
10
7
120
60
12
8
140
70
14
9
160
80
16
10
180
90
18
11
分钟准备好辣根过氧化物酶结合物工作液。 6． 从每个微孔中吸出液体。 7． 洗板 3 次：
加入洗涤液 0.35ml 到每微孔中 吸出各微孔中的溶液 8． 加入 200μ l 的辣根过氧化物酶结合物工作液到微板的每微孔中，室温下，在平板振荡器（300〜700 转/分钟）上孵育 30 分钟。 9． 从每个微孔中吸出液体。 10．洗板 3 次： 加入洗涤液 0.35ml 到每微孔中 吸出各微孔中的溶液 11．洗板后 15 分钟内，吸取 100μ l 显色溶液加入到各微孔中。 12．室温下，在平板振荡器（300〜700 转）上孵育 15 分钟，避免阳光直射。
十二. 典型数据
以下数据仅供参考，不能用来代替实时校准曲线。
25OH - ELISA
校准品 注：1 ng/ml =2.5 pmol/ml
0 ng/ ml 5.3 ng/ ml 15.0 ng/ ml 25.7ng/ ml 54.3 ng/ ml 133 ng/ ml
OD 值
2.66 2.39 1.83 1.46 0.81 0.21
个月。避免反复冻融。 - 工作洗液应在当天用当天制备。 - 试剂外观改变，可能试剂已不稳定或变质。
九．样本收集和准备
- 本试剂盒适用于血清样本。 - 血清样品必须保存在 2-8℃。 - 如果测试不能在 24 小时内完成，建议样品在-20℃的条件下储存。 - 避免反复冻融。
十．操作流程
A. 注意事项 不要使用过期的试剂盒或组分。 不要混合使用不同批号的试剂材料。 所有的试剂至室温后才能使用。 通过摇动或旋转彻底混合所有试剂和样品。 校准品，质控品和样品一式做两份。推荐重复校准。 使用干净的塑料容器准备洗涤液。 为了避免交叉污染，用干净的一次性吸头加入试剂和样品。 避免使用含金属部件的移液器来分配显色液和终止液。 精度高的移液器或自动移液设备将提高移液的精度。 遵守孵化时间。 为了减少误差，从移液第一校准品到最后一个样本之间的时间必须控制在第十三节 F 段（时间延迟） 所述的时间范围内。 每次试验必须做校准曲线，不要使用以前的试验数据。 在洗板后 15 分钟内分配显色溶液。 在与显色溶液反应时，避免阳光直射。
OD (校准品，质控品或样品) 结合率百分比 B/B0(%) = --------------------------- × 100%
OD (校准品 0)
4. 在半对数坐标纸上，绘制标准曲线。每个校准点的（B/B0（％））值为每个校准点的 25-羟基维生素 D 浓度的函数。排除离群明显的点。
5. 也可以用计算机辅助绘制校准曲线。如果使用自动结果处理，推荐使用 4PL 曲线。 6. 通过样品的（B/B0（％））的值，由校准曲线确定样品 25-羟基维生素 D 的浓度。
25-羟基维生素 D 检测试剂盒(酶联免疫法)
一. 预期用途:
用于体外定量测定人血清中的25-羟基维生素D(D2 和 D3 )的浓度。
二. 综合信息:
A. 产品名称：25-羟基维生素 D 检测试剂盒(酶联免疫法) B. 产品货号: KAP1971 96 人份
三. 临床背景:
维生素D是指维生素D2(或麦角骨化醇)和维生素D3(或胆骨化醇)的通称。皮肤暴露在日光紫外线下时, 人体可自然产生维生素D3。维生素D3和维生素D2也可通过食物膳食补充摄入。
绘制校准曲线，样品中25-羟基维生素D（D2和D3）的浓度由校准曲线插入值决定。
五．试剂组成:
试剂组分
数量
96孔板，包被了抗25-羟基维生素D2和D3的单克 隆抗体
96孔
颜色代码
使用方法
蓝色
备用
校准品0：含庆大霉素与proclin的生物基质
1瓶; 冻干品 黄色
校准品1-5 （见瓶签）：马血清与庆大霉素与 proclin的混合物
200
100
20
12
220
110
22
5. 工作洗液: 准备足够量的洗液，在 199 份的蒸馏水中加入 1 份的洗液。磁力搅拌器搅拌均匀。在一天 结束的时候丢弃未使用的工作洗液。
八．试剂的储存和保质期
- 在开瓶或复溶前， 2 到 8℃下，试剂在有效期内稳定。 - 复溶后，2 到 8℃下，校准品和质控品稳定 8 周。若需长期贮存，将试剂分装，-20℃保存，可保存 4
交叉反应（%） 100 86 20 1.9 2.9 1.3 >100 >100 0.1
为评估潜在干扰物质对使用 DIAsource 的 25-羟基维生素 D 检测试剂盒（酶联免疫法）测试样本的影响， 将不同水平的血红蛋白，胆红素，甘油三酯，维生素 C，结合和未结合胆红素，帕立骨化醇加入不同浓度 的 25-羟基维生素 D 血清中进行检测。我们的验收标准是干扰低于 10%。干扰物不影响 DIAsource 的 25羟基维生素 D 检测试剂盒（酶联免疫法）的性能。
十三. 性能和局限性
A. 检测限 检测限（LoD）是按照指导原则来计算的。检测限（LoD）为 2.81 ng/mL.
B. 特异性
25-羟基维生素 D 检测试剂盒（酶联免疫法）的交叉反应通过测定血清加或不加交叉反应物来决定。 结果总结如下表所示：
复合物与浓度 25OH-Vitamin D3 at 10ng/mL 25OH-Vitamin D2 at 10ng/mL 1,25(OH)2-Vitamin.D3 at 200ng/mL 1,25(OH)2-Vitamin.D2 at 690ng/mL
7.4
B
35
27.4 ± 1.6
5.7
B
10
26.3 ± 1.2
4.7
C
35
43.0±1.2
2.7
C
10
42.1±1.8
4.3
D
24
81.2±2.0
2.5
C
21
85.4±7.8
9.2
SD：标准偏差 CV：变异系数
D. 重复性
重复性是通过检测 3 个样本一式两份，一日两次，共 5 天来测定的。平均结果总结如下表所示：
13．在各微孔中加入 100μ l 终止液。 14．在 1 小时内，读取 450 nm 下的吸光度（参考标准滤光片 630nm 或 650nm），如第十一节中所描述的方
法计算结果。
十一. 计算结果
1. 读板, 主波长 450nm，副波长 650nm（或 630 nm）。 2. 计算重复测定的平均值 3. 依下式计算每个校准品，质控品和样品的结合率百分比：
根据使用条(微孔)的数量（如下表所示）准备足够量的辣根过氧化物酶结合物工作液。其方法：混合
浓缩结合物，浓缩的辣根过氧化物酶溶液和结合物缓冲液。
以 6 条（48 孔）为例：100uL 浓缩结合物和 50uL 浓缩辣根过氧化物酶溶液加入到 10mL 结合物缓冲剂
中。
用旋涡振荡器来混合均匀。
使用前请将辣根过氧化物酶结合物工作液在室温下保存,避免直接光照，或者用棕色器皿准备。
维生素D2的代谢过程与D3相似,共同维持个体的维生素D状态。在诊断维生素D缺乏、不足或中毒时， 测量这两种25-羟基维生素D形式是非常重要的。维生素D缺乏可能导致佝偻病，骨软化症,老年性骨质疏松 症，癌症及妊娠反应。检测25-羟基维生素D的两种形式，可以确认血钙浓度是否异常。维生素D中毒可引 起肾脏和组织损伤。
平均偏差% -0.6% -3.4%
2.5%
甘油三酯
42.5
维生素 C 生物素 帕立骨化醇
6.0 21.5 38.6 8.7 19.8 36.1 17.6 33.5
125 250 500 7.5 125 250 500 1 10 100 1 10 100 1 10 100 0.2 2 4 0.2 2 4 0.2 2 4 0.0013 0.0025 0.0050 0.0013 wenku.baidu.com.0025 0.0050
用结合物缓冲液稀释200倍
用蒸馏水液稀释200倍(磁力 搅拌器搅拌) 备用
备用
七．试剂准备:
1. 校准品 0：加入 2ml 蒸馏水复溶。 2. 校准品 1-5: 加入 1ml 蒸馏水复溶。 3. 质控品: 加入 1ml 蒸馏水复溶。 4. 辣根过氧化物酶结合物工作液。
！辣根过氧化物酶结合物工作液要在孵育过程，且至少使用前 1 小时 45 分钟准备好（cfX.B.5）。
Vitamin D3 at 200ng/mL Vitamin D2 at 200ng/mL 24,25(OH)2-Vitamin.D3 at 20ng/mL 25,26(OH)2- Vitamin D3 at 4ng/mL 3-epi-25 hydroxy vitamin D3 at 20ug/mL
物质 血红蛋白 结合胆红素 未结合胆红素
25-羟基维生素 D （ng/mL） 7.6 29.3 42.5 6.0 21.5 38.6 7.6 29.3 42.5 7.6
29.3
干扰物的浓度（mg/dL）
250 500 250 500 250 500 50 100 50 100 50 100 50 100 50 100 50 100 7.5 125 250 500 7.5
维生素D3主要在肝脏中代谢为25-羟基维生素D3（25OH D3）,是维生素D在体内循环的主要形式。25羟基维生素D3是其他维生素D代谢物的前体，具有一定的生物活性。而主要的活性物是1,25-二羟基维生素 D3，在肾脏（或胎盘）内，由25-羟基维生素D3羟基化生成。25-羟基维生素D有促进肠道钙、磷的吸收以 及骨吸收和矿化作用。并在其他组织器官（胎盘，肾脏，乳腺等）和内分泌腺（甲状旁腺，β 细胞等）中 负责钙转运。