细胞工程制药-复习

3.研究内容：细胞内活动和流动，外界对其影响，细胞间互相作用等。
4.关键：无菌操作。
（三）体外培养细胞的分型（根据：形态特征）
1.贴附型细胞：（1）成纤维型（2）上皮型（3）游走型（4）多形型
2.非贴附型（悬浮型）细胞
（四）接触抑制&密度抑制
1.接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不
优点：①理化环境可控。②细胞经培养后特征均一。③培养物可直接被观测。
④提供大量均一的细胞供制备用。⑤便于进行人工筛选。
缺点：与体内环境仍存一定差异，细胞形态或功能会发生改变。
防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！
动物细胞的特性（和微生物比较）：①大，无细胞壁。②生长慢，易污染。
③需氧量少，对剪切力敏感。④以聚集体存在。⑤原代>50代死亡。
（二）标志性事件
Carrel鸡胚浸出液细胞生长促进效应无菌技术引到组织培养技术中
Thomson 1914器官培养法
Earle 1940无限传代C3H小鼠的结缔组织细胞系
1.开始：1907 Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。
2.成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。
一、绪论
干细胞用途：①用于药物的研究或毒性的检测。②实验室中研究基因的控制与表达。
③可以用来分化培养一些治疗细胞。
（一）名词解释
1.细胞工程制药：根据细胞生物学和工程学原理，运用体外细胞培养技术定向改变细胞遗传特征，建立和创建新型细胞系（株），并通过专门的细胞培养方法研究细胞生命现象和活动规律，采用工程化的大规模细胞培养方法，探索生产方法和工艺，制造药用生化和生物制品。
（2）毛细管法。
（3）将细胞接种在不同的接种底物上。
底物
适用
多孔培养液
单细胞分离
单层琼脂
双层琼脂
饲细胞
单细胞分离，克隆形成率
软琼脂
克隆形成率（转化细胞）
碟皿（聚苯乙烯或玻璃制）
克隆形成率
5.细胞转化：细胞发生遗传性改变的一种变化。
其性状可以代代相传，能够长期维持和存在。
分为一般转化和恶性转化。
6.细胞自发转化：没有使用任何诱变剂处理下，细胞自发出现的转化现象。
⑩物种检测：检测同工酶谱⑪反转录酶检测⑫细胞建立者⑬检测者
（十三）单细胞分离培养
常用培养技术：①悬滴培养法②培养瓶培养③旋转管培养法④灌注小室培养法
培养细胞的名称：①组织来源②人名③时间地点④临床疾病类型
培养细胞的纯化：①自然纯化②人工纯化←③酶消化法④机械划除法⑤反复贴壁法
⑥克隆法，培养基限定法，流式细胞分离法等
7.人工诱发细胞恶性转化：利用化学、物理或生物的各种致癌物人为诱发细胞发生恶
性转化。
诱变剂（致癌物）：（1）物理因素：放射线。
（2）化学因素：亚硝胺类、多环芳烃、氯乙烯等。
（3）生物因素：黄曲霉素、多发瘤病毒等。
（4）促癌剂：十二癸豆蔻（TPA）
（5）间接致癌物：需经过酶活化才会形成终末致癌物。
8.细胞转化的过程：（1）诱发阶段（2）DNA的损伤与修复阶段
再增加。
2.密度抑制：培养细胞一代生长过程。
（1）游离期（2）指数生长期（3）稳定期（4）衰退期
（五）培养群体生命图
（六）原代培养期&传代培养期
1.原代（初代）培养期：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续
1~4周。
特点：（1）细胞移动较活跃。（2）异质性。（3）细胞与体内相应细胞性状相似。
（2）生化分析室——分析化验培养细胞产物
（3）温室——驯化移植
3.常用仪器与设备
（二）实验室污染
1.污染：混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括微生物和化学物质。
（1）细菌污染——表现：①变浑浊，pH改变。②胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
（2）真菌污染——表现：①培养液中漂浮着白色小点，一般不浑浊。
⑤无菌操作⑥培养；等方面工作。
1.基本实验室设置
（1）清洗室（2）制备室（3）灭菌室（4）储藏室
（5）无菌操作室：实验材料接种操作，又叫接种室。
①更衣间：鞋帽架、口罩
②缓冲间：水槽、小型仪器
③接种间（无菌间）：超净工作台、紫外灯、接种器械
（6）培养室——细胞培养（动物、植物）
2.辅助实验室设置
（1）鉴定室——对培养材料进行细胞学鉴定和研究
将细胞制成细胞悬液→接种培养后让细胞分散在底物上→适应性和活力好的细胞能增殖形
成细胞小群（克隆）
1.单细胞分离培养：又称为细胞克隆，即把一个单细胞从一个群体中分离出来单独培
养，使之重新繁衍成为一个新的细胞群体的培养技术。
2.细胞群中单个细胞形成的克隆的百分数称为克隆形成率或接种率，用来表示细胞生活力和独立生长能力。↓
单细胞悬液。
（2）克隆培养：将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一
个细胞形成一个集落，称为克隆。
3.组织培养：把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支
持物的培养瓶底来进行培养。
4.器官培养：将活体中器官或一部分器官取出，在体外生长、生存，并使其保持器官
原有的结构和功能特征的培养。
（二）动物细胞培养标志性事件&人物
A.Barli细胞融合1859黏虫生活史
首例克隆动物成功的报道1962非洲爪蟾小肠上皮细胞的核（未受精卵）
（三）脱分化&再分化
1.脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。恢复细胞的分裂活性。
高度分化的细胞，通过诱导后，失去其特定结构和功能而转变成未分化细胞（愈伤组织）的过程。
②倒置显微镜下可见菌丝排列。
③念珠菌和酵母菌呈卵形散在细胞周边和细胞之间。
（3）支原体污染——表现：①不易发现。
②电镜下可见其三层结构。
③部分敏感细胞生长变慢，部分变圆，从瓶壁脱落。但多数无明显变化。
（4）病毒污染：①采用组织细胞培养法生产疫苗，如没除去潜在病毒的组织培养物，会产
生病毒污染。
②
（5）非同种细胞污染
6.干细胞：动物体内具有分化潜能，并能自我更新的细胞。
（1）胚胎干细胞：来自囊胚期的细胞团，属于全能干细胞，每个细胞可以发育成为完整的个体。
（2）组织干细胞：存在于成体组织中，属单能或多能干细胞，可以定向分化为一种或几种不同的组织。
7.细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，在融合介子诱导下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。
（1）细胞培养基本技术（2）细胞工程常用技术（3）细胞工程制药应用技术
2.生物工程：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。
①第一代生物工程②近代生物工程③现代生物工程
（1）发酵工程（2）酶工程（3）蛋白质工程（4）基因工程
（5）细胞工程：以细胞为基本单位或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种或创造新品种；或加速繁育动、植物个体；或获得某种有用的物质的过程。
③NaHCO3溶液：调节pH值。
④抗生素液：防止污染。
2.人工合成培养基：化学成分明确的培养基，便于重复和标准化管理和控制。
（1）基本成分：氨基酸、维生素、糖、无机离子等。
（2）常用培养液：199培养液、Eagle培养液、RPMI1640培养液等。
（一十）取材方式
1.分离法
2.消化法
（十一）组织块培养法&单层细胞培养法
2.再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下转变为各种不同细胞类型的过程。
脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
（四）植物细胞工程的基础——细胞全能性
二、细胞工程基础
（一）实验室设置&仪器（6个分区）
实验室是细胞工程研究的主要场所，应能满足：①清洗②培养基制备③灭菌④储藏
2.细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。
（八）动物细胞培养条件
1.培养细胞的生存环境：（1）环境无毒和无菌。（2）适宜的温度：35~37℃。
（3）气体环境和氢离子浓度：pH7.2~7.4。（4）渗透压。（5）营养物质。（6）其它。
2.培养液的营养成分：（1）氨基酸。（2）盐类：Na、K、Mg离子。（3）葡萄糖：供能。
Ⅰ、植物细胞工程Ⅱ、动物细胞工程Ⅲ、微生物细胞工程
3.细胞与组织培养：生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。
体外（in vitro）培养——细胞工程的最基本技术
4.细胞核移植：利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂种细胞。
5.胚胎工程：以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。
（3）“转化灶”的产生。
人工诱发转化实验的程序：低血清培养。
9.肿瘤细胞的培养方法：（1）原代培养：①取材肿瘤细胞集中、活力好的部分。
②防止污染（交叉）。
③及时去除成纤维细胞。
（2）传代培养：①不要急于传代（长满培养瓶表面）。
（4）是检测药物的很好实验工具。
2.传代培养期：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后
传到新的培养瓶的过程。
（七）细胞株&细胞系
1.细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀
的培养细胞，一般为有限细胞系。
原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。
培养基表面形成的克隆数
测得的细胞总数
3.提高克隆形成率的措施：
（1）培养基：最后使用适应性培养基，即不含细胞而被细胞生活过的培养一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细