分光光度法
分光光度法
分光光度法
与不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
波长范围(1)200～400nm的紫外光区，(2)400～760nm的可见光区，(3)2.5～25μm(按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>)的红外光区。
、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。
为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。
基本原理当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸
收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:。
分光度光度法
分光度光度法分光光度法学习资料一、分光光度法的基本概念1. 定义- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。
2. 原理基础- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。
- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。
- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。
- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。
二、分光光度计的结构与组成1. 光源- 提供足够强度和稳定的连续光谱。
在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。
2. 单色器- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。
主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。
通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。
3. 样品池- 用于盛放被测溶液。
在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。
4. 检测器- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。
常见的检测器有光电管和光电倍增管等。
光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。
5. 信号显示与处理系统- 将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度或透光率等形式显示出来。
分光光度法
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。包括：比色法、可见及紫外吸光光度法和红外光谱法。本章重点介绍：可见吸光光度法。在选定波长下，被测溶液对光的吸收程度与溶液中的吸光物质的浓度有简单的定量关系。吸收光波范围是紫外，可见和红外光区。它所测量的是物质的物理性质－物质对光的吸收，测量所需的仪器是特殊的光学电子学仪器，所以光度法不属于传统的化学分析法，而属于近代的仪器分析，这里只是按照我国现行教学习惯把可见光的光度法作为化学分析部分的一章。
(一)朗伯一比耳定律的推导
当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿表面反射。设入射的单色光强度为I0，反射光强度为Ir，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，则它们之间的关系为：
I0=Ir+Ia+It
因为λ射光常垂直于介质表面射λ，Ir很小(约为λ射光强度的4％)又由于进行光度分析时都采用同样质料，同厚度的吸收池盛装试液及参比溶液，反射光的强度是不变的。因此，由反射所引起的误差可校正，抵消。故上式可简化为：
ΔE=hc/λ
这里，ΔE=E2-E1，表示某一能吸级差的能量。由于不同物质的分子其组成与结构不同，它们所具有的特征能级不同，能级差也不同，所以不同物质对不同波长的光的吸收就具有选择性，有的能吸收，有的不能吸收。在电子能级发生变化时,不可避免地也伴随着分子的振动和转动能级的变化.分子光谱又成为带状光谱.
2、溶液有色的原因。
具有单一波长的光称为单色光，在可见光中，通常所说的白光是由许多不同波长的可见光组成的复合光。由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫这些不同波长的可见光按照一定的比例混合得到白光。进一步的研究又表明，只需要把两种特定颜色的光按一定比例混合，就可以得到白光，如绿光和紫光混合，黄光和蓝光混合，都可以得到白光。
分光光度法原理
分光光度法原理
分光光度法是一种利用物质对特定波长的光吸收特性进行分析和测定的方法。
该方法利用了物质对特定波长光的吸收现象，通过测量光线通过样品溶液后的光强度的差异来分析溶液中物质的含量或浓度。
分光光度法的原理基于比尔－朗伯定律，该定律认为物质对光的吸收量与光通过物质的路径长度和物质溶液中物质的摩尔浓度成正比。
根据比尔－朗伯定律，光的吸收量与样品中物质的浓度存在线性关系。
通过测量样品溶液对特定波长光的吸收强度，可以推断出溶液中物质的浓度。
分光光度法的实验步骤一般包括以下几个方面：首先，选择适合的波长进行测量，波长的选择要使得被测物质对光的吸收峰值较大；其次，通过一束光线照射样品溶液，光线经过溶液后，通过一个光电传感器测量光线透过样品溶液后的强度；然后，将测得的光强度与参比溶液的光强度（即溶液中被测物质浓度为零时的光强度）进行比较，得到样品溶液中被测物质的浓度；最后，根据相关的浓度与光吸光度定量关系，计算出样品溶液中被测物质的精确浓度。
分光光度法具有灵敏度高、测量范围广、操作简便等优点。
由于可以选择不同波长的光进行测量，在不同波长下对不同物质的测量具有选择性。
这使得分光光度法在许多领域中被广泛应用，如生物化学、药学、环境科学等。
分光光度法的原理
分光光度法的原理分光光度法是一种用于测定溶液中物质浓度的分析方法，其原理基于溶液中物质对特定波长的光的吸收特性。
通过测量溶液对光的吸收程度，可以推断出其中物质的浓度，从而实现对溶液中物质含量的定量分析。
在进行分光光度法测定时，首先需要选择一种适合的光源，通常会选择具有单一波长的光源，如汞灯、钠灯或氖灯等。
然后，将光源发出的光线通过准直器和单色器，使其变成单一波长的单色光，再通过样品室中的溶液，溶液中的物质会吸收特定波长的光，其吸收程度与溶液中物质的浓度成正比。
最后，通过光电检测器测量透过样品室的光的强度，根据光的吸收程度可以计算出溶液中物质的浓度。
分光光度法的原理简单清晰，测定精度高，操作方便快捷，因此在实际应用中得到了广泛的应用。
在环境监测、生物医学、食品安全等领域，分光光度法都发挥着重要作用。
例如，在环境监测中，可以利用分光光度法测定水体中有机物、重金属离子等的浓度，从而评估水质的污染程度；在生物医学领域，可以利用分光光度法测定血液中的葡萄糖、蛋白质等物质的浓度，用于疾病诊断和治疗监测；在食品安全领域，可以利用分光光度法测定食品中的添加剂、农药残留等有害物质的含量，保障食品安全。
当然，分光光度法也存在一些局限性，例如在样品中存在多种吸收波长相近的物质时，会造成测定的误差；另外，在测定高浓度样品时，也会受到吸收饱和的影响。
因此，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的分光光度法测定条件，以确保测定结果的准确性和可靠性。
总之，分光光度法作为一种重要的分析方法，具有测定精度高、操作简便、应用广泛等优点，对于溶液中物质浓度的测定具有重要意义。
在今后的实验和工作中，我们可以根据具体情况选择合适的分光光度法测定条件，灵活运用这一分析方法，为科研和生产工作提供可靠的数据支持。
分光光度法分类
分光光度法分类
分光光度法是一种常用的化学分析方法，它利用物质对特定波长的光的吸收来测定物质的浓度。
根据测定原理和测定范围的不同，分光光度法可以分为多种分类。
一、紫外可见分光光度法
紫外可见分光光度法是利用物质对紫外或可见光的吸收来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于生物化学、环境监测、食品检测等领域。
紫外可见分光光度法的优点是测定灵敏度高，测定速度快，操作简便，但其缺点是对样品的透明度和颜色有一定的要求。
二、原子吸收光度法
原子吸收光度法是利用物质对特定波长的光的吸收来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于金属元素的分析和测定。
原子吸收光度法的优点是测定精度高，测定范围广，但其缺点是对样品的处理要求高，操作复杂。
三、荧光光度法
荧光光度法是利用物质在受到激发后发出荧光来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于生物化学、环境监测、食品检测等领域。
荧光光度法的
优点是测定灵敏度高，测定速度快，但其缺点是对样品的处理要求高，操作复杂。
四、化学发光光度法
化学发光光度法是利用化学反应产生的发光来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于生物化学、环境监测、食品检测等领域。
化学发光光度
法的优点是测定灵敏度高，测定速度快，但其缺点是对样品的处理要
求高，操作复杂。
总之，分光光度法是一种非常重要的化学分析方法，它在生物化学、
环境监测、食品检测等领域都有广泛的应用。
不同的分光光度法有不
同的优缺点，我们需要根据具体的实验要求来选择合适的方法。
分光光度法
原子发射光谱法 (atomic emission photometry) 分子发光分析法
II. 可见-紫外分光光度法
一、概述
1、定义：
利用物质的分子或离子对某一波长范围 的光的吸收作用，对物质进行定性、定量 及结构分析的方法
3、所用仪器： 分光光度计(spectrophotometer)
（1）主要部件：
信
光 源
单
吸
检
色
收
测
器
池
器
号 显 示 系
统
（2）使用： 1．开电源开关，打开箱盖，预热10min
2．将空白管、对照管、测定管分别装入 比色皿(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁
3．选定波长
4．打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空 白管调T=0
5. 盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空 白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏 度开关)
6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0， 否则调节“消光零”旋钮调至0
7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度 值A
8．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)， 关闭开关
4、比色法的定量方法：
①标准曲线法: 将一系列浓度不同的标准溶液按照一定
选择吸收
----组成物质的分子仅吸收与其内能变化 (基态与激发态能量差)相对应的波长或 频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱
能量释放
----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳 定，当其返回基态时，以热或发射光谱的 形式将能量释放出来。所发射出的相应光 谱，称分子发射光谱
激发态 发 射 光 谱
E1 吸 收 光 谱
13 第十三章(分光光度法)
有一浓度为1.0 µg · mL - 1 Fe2+的溶液，以邻二氮菲 的溶液， 例 有一浓度为 显色后， 显色后，在比色皿厚度为 2 cm、波长 、波长510nm处测得吸光度为 处测得吸光度为 0.380，计算 透光率 ；(2) 吸光系数 ；(3) 摩尔吸光系数ε 。 透光率T； 吸光系数a； ，计算(1)透光率
动性、粒子性。 动性、粒子性。
E = h ⋅ν = h
c
λ
常数： （Planck常数：h=6.63× 10 -34 J · S ) 常数 ×
上式表明光的波长越短， 上式表明光的波长越短，或者说频率越 大，光的能量越高。 光的能量越高。
具有同一波长的光称为单色光 单色光。 ● 具有同一波长的光称为单色光。 (由具有相同能量的光子组成 由具有相同能量的光子组成) 由具有相同能量的光子组成 ● 不同波长组成的光称为复合光。 不同波长组成的光称为复合光。 复合光 ● 日常生活中肉眼所见到的 白光 ， 如 日 日常生活中肉眼所见到的白光 白光， 等是由红、 光 等是由红 、 橙 、 黄 、 绿 、 青 、 蓝 、 紫等光按 适当的强度比例混合而成的， 是在400~750nm 适当的强度比例混合而成的 ， 是在 范围的一种复合光。 范围的一种复合光。
I0 1 A = lg = lg = − lg T It T
若光全部透过溶液， 若光全部透过溶液，Io= It ， A = 0 若全部被吸收， It = 0 ， A = ∞ 若全部被吸收， 吸光度A是用来衡量溶液中 吸光度 是用来衡量溶液中 吸光物质对单色光 λ 的吸收程度 值越大， ，A值越大，其吸收程度越大； 值越大 其吸收程度越大； 反之亦然。 反之亦然。
UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV) UV- 主要用于分子的定量分析， 和红外光谱( 为四大波谱之一， 和红外光谱(IR)为四大波谱之一，是鉴定许多化合
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
分光光度法的基本原理
分光光度法的基本原理
分光光度法是一种常用于分析、确定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质溶液通过一束光束，然后通过光学系统使光束分成两部分，分别通过样品液和对照液，最终两束光束再重合形成一个荧光强度差。
待测物质会对入射光束进行吸收，导致出射光束的强度减弱，而对照液不会对光束产生吸收作用，出射光束强度不变。
通过测量两束光的强度差异，可以推断待测物质的浓度。
分光光度法使用光栅或棱镜使入射光束通过色散，然后通过滤光片选择特定波长的光，再通过样品液和对照液后，出射光会被光电池或光电二极管接收，转化为电信号。
根据输出的电信号强度，可以计算出待测物质的浓度。
分光光度法的优点是测量精度高、灵敏度高、操作简便。
它可以在高浓度样品中进行测量，可以使用各种波长的光来进行分析。
然而，它也存在一些限制，例如对色散（波长漂移）的影响比较大，需要定期校准光谱仪器。
此外，分光光度法对于有色物质的测量更准确，对于无色物质的测量精度较低。
分光光度法的原理是什么
分光光度法的原理是什么分光光度法是一种用于测定物质浓度或溶液中某种物质含量的方法，它利用物质对光的吸收或透射特性来进行分析。
这种方法是化学分析中常用的一种定量分析方法，具有灵敏度高、准确度高、操作简便等优点。
分光光度法的原理主要涉及光的吸收、透射和比色原理。
首先，我们来看光的吸收。
当物质处于激发态时，它会吸收特定波长的光，这种吸收是由于物质分子内部的电子跃迁所引起的。
分子吸收光的能力与其分子结构、电子能级、分子振动等因素有关。
根据分子的吸收特性，我们可以利用分光光度法来测定物质的浓度。
其次，光的透射也是分光光度法的原理之一。
当光通过物质时，部分光会被物质吸收，而剩余的光则会透射出来。
透射光强度与物质的浓度成正比，这为我们提供了一种测定物质浓度的方法。
通过测量透射光强度，我们可以推断出物质的浓度，从而实现定量分析。
最后，比色原理也是分光光度法的重要原理之一。
在分光光度法中，我们常常会使用比色皿或比色皿来进行测定。
这种比色皿可以使我们测量样品溶液的吸光度，进而推断出物质的浓度。
比色皿的选择、使用方法和测量条件都会对实验结果产生影响，因此在进行分光光度法分析时需要严格控制这些因素。
总的来说，分光光度法是一种基于物质对光的吸收或透射特性进行定量分析的方法。
它的原理涉及光的吸收、透射和比色原理，通过测量样品溶液的吸光度或透射光强度，我们可以推断出物质的浓度。
分光光度法具有操作简便、准确度高、灵敏度高等优点，因此在化学分析领域得到了广泛的应用。
通过深入了解分光光度法的原理，我们可以更好地掌握这种分析方法，为科研工作和实验室分析提供有力的支持。
分光光度法实验报告
一、实验目的1. 理解分光光度法的基本原理及其在定量分析中的应用。
2. 掌握分光光度计的使用方法，包括光源的选择、波长调节、比色皿的清洗和校准等。
3. 通过实验，学会如何根据样品的吸光度与浓度之间的关系绘制标准曲线，并利用标准曲线测定未知样品的浓度。
二、实验原理分光光度法是一种基于物质对特定波长光的吸收特性进行定量分析的方法。
根据朗伯-比尔定律，当一束单色光通过均匀的溶液时，溶液的吸光度与溶液中溶质的浓度和光程成正比。
公式表示为：A = εlc，其中A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，l为光程（通常为比色皿的厚度），c为溶液的浓度。
三、实验仪器与试剂仪器：1. 分光光度计2. 比色皿3. 移液管4. 容量瓶5. 烧杯试剂：1. 标准溶液：已知浓度的待测物质溶液2. 未知溶液：待测浓度的溶液3. 水为GB/T 6682规定的二级水或去离子水四、实验步骤1. 仪器准备：- 开启分光光度计，预热30分钟。
- 调节光源，选择合适的波长。
- 清洗比色皿，并用待测溶液润洗3次。
2. 标准曲线绘制：- 取若干个比色皿，分别加入不同浓度的标准溶液。
- 用移液管准确移取一定体积的标准溶液于比色皿中，加入适量的溶剂，摇匀。
- 将比色皿放入分光光度计中，记录吸光度值。
- 以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 未知溶液浓度测定：- 取若干个比色皿，分别加入一定体积的未知溶液。
- 用移液管准确移取一定体积的未知溶液于比色皿中，加入适量的溶剂，摇匀。
- 将比色皿放入分光光度计中，记录吸光度值。
- 在标准曲线上找到对应的吸光度值，即可得到未知溶液的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：通过实验，成功绘制了标准曲线，证明了朗伯-比尔定律在分光光度法中的应用。
2. 未知溶液浓度测定：根据标准曲线，准确测定了未知溶液的浓度。
六、实验总结本次实验通过分光光度法测定了未知溶液的浓度，成功实现了定量分析。
实验过程中，掌握了分光光度计的使用方法，学会了如何绘制标准曲线和测定未知溶液的浓度。
分光光度原理
分光光度原理分光光度法是一种利用物质对光的吸收、透射或散射特性来定量分析物质的方法。
它是利用物质对特定波长的光的吸收或透射来测定物质的浓度或含量的一种分析方法。
分光光度法具有灵敏度高、精密度高、选择性好、操作简便、分析速度快等优点，因此在化学、生物、医药、环境等领域得到了广泛的应用。
分光光度法的基本原理是根据比尔定律，即物质溶液对单色光的吸收与其浓度成正比。
当物质溶液中存在多种物质时，各种物质对光的吸收是相互独立的，可以分别进行测定。
在进行分光光度测定时，首先需要选择合适的光源和检测器。
常用的光源有白炽灯、钨丝灯、氘灯、氙灯等，而检测器则有光电离检测器、光电二极管检测器、光电倍增管检测器等。
选择合适的光源和检测器可以保证测定的准确性和可靠性。
其次，需要选择合适的滤光片或单色仪，以确定所需要的波长。
根据被测物质的吸收特性，选择合适的波长可以提高测定的灵敏度和选择性。
在进行测定时，需要将待测溶液置于光路中，使其与光发生相互作用。
根据被测物质的吸收特性，可以测定其吸光度或透光度。
通过测定吸光度或透光度，再根据比尔定律可以计算出被测物质的浓度或含量。
分光光度法可以应用于多种物质的测定，如金属离子、有机物、生物分子等。
在环境监测中，可以利用分光光度法测定水中重金属离子的含量；在食品安全监测中，可以利用分光光度法测定食品中的添加剂含量；在生物医药领域，可以利用分光光度法测定生物样品中的蛋白质、核酸等。
总之，分光光度法作为一种快速、准确、灵敏的分析方法，在化学、生物、医药、环境等领域得到了广泛的应用。
通过选择合适的光源和检测器，确定合适的波长，以及准确测定吸光度或透光度，可以实现对各种物质的快速、准确的测定，为科学研究和生产实践提供了重要的技术支持。
分光光度法
本章小结
基本概念：吸光度，透光率，吸光系数， 最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收 曲线，标准曲线
基本计算：A =εbc
A = -lgT = lg I 0 It
测定方法：标准曲线法 标准对照法
判断题
1. 分光光度法灵敏度高，特别适用于常量
组分的测定。 （× ）
2. 光 照 射 有 色 溶 液 时 ， A 与 T 的 关 系 为
质量吸光系数a, 单位: Lg -1cm-1
吸光系数
与入射光的波长、物质的性质、溶 剂和温度有关；与浓度无关；
≥103，可用于定量测定； 与λmax一起可以作为定性的依据。
Lambert―beer定律
A =εbc
A ═ ab ε= aM
T =10-bc
适用条件 Preconditions:
A. 向短波方向移动
B. 向长波方向移动
√C. 不改变，但峰高度改变
D. 不改变，峰高度也不变
E. 改变，但峰高度不变
7．分光光度法中使用试剂空白作对照的目的 是：
A. 用以消除仪器测量误差 B. 用以消除溶液偏离Beer定律引起的误差 C. 用以消除单色光纯度差引起的误差
√D. 用以消除溶剂、显色剂等物质对入射光
① c 一定, A∝b Lambert ② b 一定, A∝c Beer
A =εbc
三、Lambert-Beer定律
A =bc
溶液厚度b, 单位:cm
浓度c，单位molL-1
摩尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1
若用质量浓度代替c
A = ab
质量浓度 , 单位: gL-1
吸光度的加合性 Addition of A
分光光度法
吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得 的图谱为吸收光谱。
利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析 的方法称为吸收光谱法, 简称光谱法。
三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A） 入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）
一、光的性质与波长范围
光的性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。
光在传播时表现了光的波动性
一定的光波具有一定的波长 、频率 、光速c等 参数来描述:
c=
续前:
波长: 相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示:
1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）: 是每秒内光波的振动次数，单位是
A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气
体和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A
E= CL
当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种：
1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为 1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。
分光光度法公式
分光光度法公式分光光度法相关公式如下：一、朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）1. 基本表达式。
- A = lg(I_0)/(I)= varepsilon bc- A：吸光度（Absorbance），表示物质对光的吸收程度，无单位。
- I_0：入射光强度（Intensity of incident light）。
- I：透射光强度（Intensity of transmitted light）。
- varepsilon：摩尔吸光系数（Molar absorptivity），单位为L· mol^-1·cm^-1，它反映了吸光物质对光的吸收能力，与吸光物质的性质、入射光波长、温度等因素有关。
- b：光程长度（Path length），即溶液厚度，单位为cm。
- c：吸光物质的浓度（Concentration），单位为mol/L。
2. 从吸光度计算浓度。
- 根据朗伯 - 比尔定律c=(A)/(varepsilon b)，如果已知某物质的摩尔吸光系数varepsilon、光程长度b和测得的吸光度A，就可以计算出该物质的浓度c。
二、多组分体系的分光光度法。
1. 吸光度的加和性。
- 对于含有n种吸光组分的溶液，在某一波长下的总吸光度等于各组分吸光度之和，即A = A_1+A_2+·s+A_n=∑_i = 1^nvarepsilon_ibc_i。
- 例如，对于两种组分1和2的混合溶液，A=varepsilon_1bc_1+varepsilon_2bc_2。
如果能在两个不同波长λ_1和λ_2下测量吸光度，就可以得到联立方程：- 在λ_1下：A_λ_1=varepsilon_1,λ_1bc_1+varepsilon_2,λ_1bc_2- 在λ_2下：A_λ_2=varepsilon_1,λ_2bc_1+varepsilon_2,λ_2bc_2- 解这个联立方程就可以求出两种组分c_1和c_2的浓度。
分光光度法的原理
分光光度法的原理分光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物化学领域的分析方法，它利用物质对光的吸收、散射或透射特性来定量分析物质的含量。
其原理是利用物质对特定波长的光的吸收特性来确定物质的浓度，是一种非常重要的分析方法。
首先，我们来了解一下分光光度法的基本原理。
分光光度法是利用物质对特定波长的光的吸收特性来进行定量分析的一种方法。
当物质处于基态时，它会吸收特定波长的光，使得物质内部的电子跃迁至激发态，这种吸收是有选择性的，只有特定波长的光才能被吸收。
根据比尔-朗伯定律，物质吸收光的强度与物质的浓度成正比，因此可以通过测量吸收光的强度来确定物质的浓度。
其次，分光光度法的原理还涉及到光的衰减规律。
当光通过含有物质的溶液时，部分光会被溶液吸收、散射或透射，导致光的强度减弱。
根据比尔-朗伯定律，溶液中物质的浓度越高，光的衰减越严重，因此可以通过测量衰减后的光强度来确定溶液中物质的浓度。
另外，分光光度法还需要考虑到光的色散效应。
由于不同波长的光在物质中的吸收程度不同，因此需要使用具有一定波长范围的光源，并通过光栅或棱镜将光分解成不同波长的光，然后选择特定波长的光进行测量。
这样可以避免由于光的色散效应而导致的测量误差。
总的来说，分光光度法的原理是基于物质对特定波长光的吸收特性来进行定量分析。
通过测量吸收光的强度、分析光的衰减规律以及考虑光的色散效应，可以准确地确定物质的浓度。
这种分析方法具有灵敏度高、准确性高、操作简便等优点，因此在化学分析和生物化学领域得到了广泛的应用。
在实际应用中，分光光度法可以用于测定各种物质的浓度，如溶液中金属离子、有机物质、生物分子等的含量。
它不仅可以用于定性分析，还可以用于定量分析，具有广泛的应用前景。
综上所述，分光光度法是一种重要的分析方法，其原理基于物质对光的吸收特性来进行定量分析。
通过测量吸收光的强度、分析光的衰减规律以及考虑光的色散效应，可以准确地确定物质的浓度。
这种分析方法具有灵敏度高、准确性高、操作简便等优点，在化学分析和生物化学领域得到了广泛的应用。
分光光度法(金)
3)应用
①标准曲线法 ②标准管法
①标准曲线法
特点：方便、快捷，适用于大批量样品处理
方法： a.标准曲线绘制
配制一系列与待测样品溶质相同的，浓 度由小到大的标准溶液，分别测OD值。
D
0
C
b. 未知样品浓度测定
D Dx
0
Cx
C
②标准管法
特点：相对准确，适用于少量样品处理
方法：设标准溶液，浓度已知，分别测样品和标准
溶液的OD值。
D测 = K L C测 D标准 = K L C标准
D测 C测 = D标准 ×C标准
4)分光光度法的优点
灵敏：能测定出溶液中含量极少的物质浓度 准确：误差小，与真实值非常接近 快速：操作步骤简单，较少时间内得出结果 简便：无需从溶液中分离待测样品
5)分光光度法所使用的仪器 ——分光光度计
③以酪蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标， 绘制标准曲线；
2. 未知样品浓度测定：
取5号管， 吸取1ml （1：10稀释）血清待测样, 用水补足至2ml，加入双缩脲试剂4ml，混匀后与 以上4管同时比色，从标准曲线查出其蛋白质浓度 ，按稀释倍数求出血清原液浓度。
3. 标准管法：
C测 =
D测 D标
×
实验一 用分光光度法 测定血清蛋白含量
【实验目的】
1.掌握标准曲线的制备方法和标准管法 的计算方法；
2. 掌握双缩脲法测定血清蛋白的原理和 方法。
【实验原理】
呈色反应 茚三酮反应
双缩脲反应 √
尿素被加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合 放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条 件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。 此反应称为双缩脲反应。
分光光度法 科普
分光光度法科普
分光光度法是一种通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法之一。
分光光度法的原理是基于Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。
若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著。
这一关系就是郎伯定律。
分光光度法的应用范围非常广泛，可以用于测定多种物质，如蛋白质、核酸、糖类、酚类、芳香族化合物等。
在临床医学、环境科学、生物工程、制药等领域都有广泛的应用。
需要注意的是，分光光度法在使用过程中需要注意一些问题，如选择合适的波长和光源，避免干扰物质的影响，以及正确处理数据等。
此外，分光光度计也需要定期进行校准和维护，以保证测量的准确性和可靠性。
总之，分光光度法是一种简单、快速、灵敏的分析方法，在各个领域都有广泛的应用。
通过了解其原理和方法，可以更好地应用于实际工作中。
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第十章 吸光光度法吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
吸光光度法或光度分析根据入射光的波长范围可分为紫外吸收光谱法、可见分光光度法、红外光谱法。
可见吸光光度法又分为比色法（光电比色法和目视比色法）和分光光度法。
目视比色法：基于有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深。
通过与标准色阶比较颜色深浅的方法确定溶液中有色物质的含量。
目视法仪器简单，操作简便，但灵敏度和准确度不如分光光度法，只是在一些准确度要求不高的分析中仍有一定的实用性。
如果用光电比色计代替人眼观察，则为光电比色法。
分光光度法：如果是使用分光光度计，利用溶液对单色光的吸收程度来确定物质含量，则称为分光光度法。
分光光度法灵敏度较高，可不经富集直接测定低至5510%-⨯微量组分。
一般情况下，测定浓度的下限也可达0.11()g ppm g μ，相当于含量为0.001%0.0001%的微量组分。
如果是采用高灵敏度的显色试剂，或事先将待测组分加以富集，甚至可能测定低至6710%10%--的组分。
虽然光度法的准确度相对于重量分析法和滴定分析法要低得多，通常分光光度法的相对误差为2%5%（比色法为5%20%），但这已经能满足一般微量组分测定准确度的要求。
若用差示分光光度法，其相对误差甚至可达0.5%，已接近重量分析法和滴定分析法的误差水平。
相反滴定分析法或重量分析法却难于完成这些微量组分的测定。
光度分析技术比较成熟，所需仪器相对廉价，操作简便易行，已广泛用于工农业生产和生物、医学、临床、环保等领域。
几乎所有的金属元素和众多的有机化合物都可用光度法测定。
我们主要学习可见分光光度法。
§10.1物质对光的选择性吸收一、光的基本性质光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。
光的折射、衍射、偏振和干涉等现象可用光的波动性来解释。
描述波动性的重要参数是波长（cm ），频率ν（Hz ）。
它们与光速的关系是：c νλ= 真空中101310c cm s -=⨯ 光电效应、光的吸收和发射等，只能用光的微粒性才能解释，即把光看作是带有能量的微粒流。
这种微粒称为光子或光量子。
单个光子的能量E 决定于光的频率。
c E h h νλ== E 为光子的能量（J ），h ：普朗克常数（346.62610J s -⨯） 理论上，将仅具有某一波长的光称为单色光，单色光由具有相同能量的光子组成。
由不同波长的光组成的光称为复合光。
当人为地按照波长将电磁波划分为不同的区域时，得到电磁波谱或光谱（见表10-1）。
其中400750nm波长范围内的光为可见光。
由于受人的视觉分辨能力的限制，人们所看见的各种颜色，如黄色、红色等，实际上是可见光区中含一定波长范围的各种色光，即各种色光也是一种复合光。
二、物质的颜色和对光的选择性吸收颜色是物质对不同波长光的特征吸收表现在人视觉上所产生的反映。
如果把不同颜色的物体放在暗处，什么颜色也看不到。
当光束照射到物体上时，由于不同物质对于不同波长的光的吸收、透射、反射、折射的程度不同而呈现不同的颜色。
溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。
当让含有可见光区整个波长的多色光（白光）通过某一有色溶液时，该溶液会选择性吸收某些波长的色光而让那些未被吸收的色光透射过去即溶液呈现透射光的颜色，人们将被吸收的色光和透射过去的色光称为互补色光。
KMnO水溶液能吸收绿色光而呈现紫红色，则紫红色和绿色互为互补色。
例如4若物质对白光中所有颜色的光全部吸收，它就呈现黑色；若反射所有颜色的光则呈现白色；若透过所有颜色的光，则为无色。
三、物质对光产生选择性吸收的原因物质的分子内部具有一系列不连续的特征能级，包括电子能级、振动能级和转动能级，这些能级都是量子化的，其中电子能级又可分为基态和能量较高的若干个激发态。
一般，物质的分子都处于能量最低最稳定的基态。
当用光照射某物质后，如果光具有的能量恰好与物质分子的某一能级差相等时，这一波长的光就被吸收。
从而使物质发生能级跃迁。
由于不同物质结构不同，所以能级也不同，对光的选择性吸收也不同。
四、吸收光谱（吸收曲线）让不同波长的单色光依次照射某一吸光物质，并测量该物质在每一处对光吸收程度的大小（吸光度），以λ为横坐标，A 为纵坐标作图。
得到一条吸光度随波长变化的曲线叫吸收曲线。
从吸收曲线中可以看到物质往往对某一波长的光有最大吸收，我们称max A 处的λ为max λ（最大吸收波长）。
如4KMnO max 525nm λ=。
①max λ和曲线的形状由物质的结构决定，可用于定性分析。
②而c 不同，则A 不同，可用于定量分析。
10-23§10.2 光吸收定律一．朗伯——比尔定律1760年，朗伯（LamBer ）指出，当单色光通过浓度一定的均匀的吸收溶液时，溶液对光的吸收程度与液层厚度b 成正比，这种关系称为朗伯定律：01tI lgK b I = 0I ：入射光的强度；t I 透射光的强度。
1852年，比尔指出，当单色光通过液层浓度一定的均匀吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与吸光物质的浓度成正比。
这种关系称为比尔定律，数学表达式为：02tI lg K c I = 如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，既将上述两个定律结合起来，则可得：02tI A lg K bc I == b ：液层厚度（cm ） c ：吸收物质的浓度 K ：比例常数朗伯—比尔定律不仅适用于可见光区，也适用于紫外和红外光区；不仅适用于溶液，也适用于其它均匀的，非散射的吸光物质（包括气体和固体），是各类吸光光度法的定量依据。
0t I lg I 项表明了溶液对光的吸收程度，定义为吸光度（A ）A =0t I lg I ，而0t I I 是透射光强度与入射光强度之比，表示了入射光透过溶液的程度，称为透光度（以%表示透光率），以T 表示。
t I T I = 01t I A lg lg Kbc I T=== 当b 一定时，A ∝c ，前提是一束平行单色光垂直通过某一非散射的吸光物质。
二．吸光系数1、吸收系数a当b 的单位为cm ，c 的单位是1g L -时，K 用a 表示，其单位为11L g cm --A=abc2. 摩尔吸光系数当b 的单位为cm ，c 的单位是1mol L -时，K 用ε表示，称为摩尔吸光系数，其单位11L mol cm --。
A bc ε=ε的物理意义：当吸光物质的浓度为11mol L -，吸收层厚度为1cm ，吸光物质对某波长的光的吸光度。
在λ、T 和溶剂等条件一定时，ε的大小取决于物质本身的性质，是物质的特征值。
同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时，具有不同的ε值，同一化合物在不同的波长处的ε亦可能不同。
在max λ处摩尔吸光系数，常以max ε表示。
ε越大，表示该有色物质对入射光的吸收能力越强，显色反应越灵敏。
所以，可根据不同的显色剂与待测组分形成有色化合物的ε值大小，比较它们对测定组分的灵敏度。
三．桑德尔灵敏度S定义：当光度仪器的检测极限为0.001=1时，单位截面积光程内所能检出的光物质的最低质量。
其单位为2m cm μ-。
S 越小，显色反应的灵敏度越高。
根据定义： A =0.001=abc 时bc =0.001/a （1）b 单位为cm ，c 的单位是1g L μ-时，b c 就是单位截面积（2cm ）光程内吸光物质的含量（g μ），则S ()3210bc g cm μ-=将（1）式代入上式： 1S a= 由a 和ε的定义可知： ε= aMM S ε=()2g cm μ- 四．朗伯—比尔定律的偏离根据A bc ε=知，ε、b 一定时，A c ∝，所以，用A 作纵坐标，c 为横坐标做图，应该是通过圆点的直线，但实际不完全相符。
原因是：1.物理因素（1）非单色光引起的偏离假设入射光为1λ和2λ两个波长的光，强度为01I 和02I ，c 为浓度，b 为吸收池厚，透射光为11I 和12I对于1λ 011112I A Lg bc I ε== 1110110bc I I ε-∴= 2λ 022212I A Lgbc I ε== 2120210bc I I ε-∴= 实际测得结果是A 总 010211120t I I I I I I =+=+总总； 1201020102111201021010bc bcI I I I A lg lg I I I I εε--++∴==++总 若12εεε==，则()010*******bc I I A lg bc I I εε-+==+总 即A c ∝总若λ∆较大或12εε≠，则不符合朗伯—比尔定律。
（2）非平行光入射非平行光程b '大于吸收池厚度b ，使实际待测值A 大于理论值产生的吸光度偏高。
（3）介质不均匀当物质不均匀，会因散射而损失部分光，使透射比减小，测得A 偏高，当c 越大，散射越大，偏离越多。
2.化学因素（1）浓度过高c 过高，质点间有了相互作用，改变了微粒的电荷分布。
所以适用于稀溶液。
2．化学反应引起的偏高因为M R MR +（有色物），为了使不同溶液的M 与R 在相同的条件下反应，往往加入相对过量的R 。
这样，由于[]MR 浓度与M c 不成正比，而使A 、C 不成正比。
又如227K Cr O 在溶液中有下列平衡：2227244222Cr O H O HCrO H CrO --+-++测227K Cr O 溶液的吸光度时，如果于波长350nm 处进行，则随着227K Cr O 浓度增加，其中24CrO -的相对浓度越来越小，结果将导致标准曲线向下弯曲。
如果是在450nm 处测定（灵敏度较低），标准曲线将向下弯曲。
如果在等吸收点波长445nm 处进行测量，则尽管227Cr O -离解为24CrO -，也不会发生偏离L-B 定律的情况。
§10.3 分光光度法的仪器一．分光光度计的组成分光光度计通常由光源、单色器、吸收池、检测系统和信号显示系统五大部分组成。
10-51．光源钨灯()360800nm ——可见光区用氢灯或氘灯()185375nm ——紫外光区用要求：能够发射有足够的强度、稳定且波长连续变化的复合光。
2．单色器（分光系统）凡是能把复合光分解为按波长顺序排列的单色光，并且能通过出射狭缝分离出某一波长单色光的仪器，称为单色器，亦称为分光器。
它由入射狭缝、出射狭缝，反射镜和色散元件组成，关键部件是色散元件。
色散元件有两种基本形式：棱镜和衍射光栅。
（1）棱镜由玻璃或石英制成。
复合光通过棱镜时，折射率与入射光的波长有关。
对一般的棱镜材料在紫外—可见光区，折射率与波长之间的关系，可用科希经验公式表示：24B C n A λλ=++ n ：波长为λ的入射光的折射率。