实验六、细菌分解代谢系列实验

3、明胶液化试验
明胶是一种动物蛋白。明胶培养基本身低于 20℃时凝固，高于25℃则自行液化。某些细 菌能够产生蛋白酶将明胶水解成小分子物质， 因此培养后的培养基即使在低于20℃的温度 下，明胶也不再凝固，而由原来的固体状态 转化为液体状态。
三、操作步骤：

（一）淀粉水解试验：
(1)准备淀粉培养基平板：将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基 倒入无菌平皿中，待凝固后制成平板。

（二）油脂水解试验：
（1）将装有油脂培养基的三角瓶置于沸水浴中 熔化，取出并充分振荡（使油脂均匀分布）， 再倾入无菌平皿中，待凝固制成平板。
（2）划线接种于同一平皿的两边(其中一种是 金黄色葡萄球菌作为对照菌)。置于37℃恒温箱 培养24h，取出后观察平板底层长菌的地方， 如出现红色斑点，即说明脂肪被水解了，此反 应为正反应。

（三）明胶液化试验：
（1）接种：用穿刺接种法接种大肠杆菌或产气肠杆菌 于明胶培养基中。
（2）培养：放20℃恒温箱中培养48h。若细菌在20℃下 不长，则应放在最适温度下培养。 （3）观察结果：观察培养基有无液化情况及液化后的 形状。 因明胶在低于20℃时凝固，高于25℃时自行液化，若 是在高于20℃下培养的细菌，观察时应放在冰浴中观 察，若明被被细菌液化，即使在低温下明胶也不会再 凝固。
二、实验原理

1、乙酰甲基甲醇试验 a、实验目的：检测细菌分解葡萄糖的代谢产物 b、原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸脱羧通过缩合和脱羧后转变 成乙酰甲基甲醇，然后被还原成2，3—丁二醇。 乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被空气中的氧气氧 化成为二乙酰，二乙酰再与蛋白胨中的精氨酸的 胍基作用生成红色化合物，此为乙酰甲级甲醇反 应。在试管中加入α—萘酚时，可促进反应出现。
三、注意事项
1、V．P．反应中加入NaOH溶液和肌酸后要反复振荡试管，使空 气中氧溶入培养液中。 2、甲基红试验中，不要过多滴加甲基红指示剂，以免出现假阳性 反应。
3、吲哚试验中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨 (用胰蛋白酶水解酪 素，得到的蛋白胨中色氨酸含量较高)配制蛋白胨水培养基，否 则将影响产吲哚的阳性率；在加入吲哚试剂后切勿摇动试管， 以免破坏乙醚层而影响结果。

2、甲基红试验
a、实验目的：检测细菌是否能分解葡萄糖产生酸。
b、实验原理：某些细菌在糖代谢过程中，将培养 基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲 酸、乙酸、乳酸等。有机酸的产生可由加入甲基 红指示剂的变色进行检测。甲基红的变色范围 PH4.2(红)—6.3（黄），细菌分解葡萄糖产酸，将 培养液由原来的橘黄色变为红色，此为甲基红反 应。

四、试验结果
记录每个试验的结果



淀粉水解 油脂水解 明胶液化
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌



糖发酵（乳糖、葡萄糖）：大肠杆菌、普通变 形菌 吲哚 甲基红、V.P. 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 柠檬酸盐：
（3）在V.P实验留下的培养液中，各滴加1滴/ml甲基红指示剂， 注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若变为红色，即为阳 性反应，若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”“—”表示。

（二）吲哚试验
(1)接种：将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接种于蛋白胨 水培养基中。
(2)培养：将接种好的试管放37℃恒温培养箱内恒温培 养24h。 (3)结果观察；在培养液中加入乙醚约1mL(使呈明显乙 醚层)，充分振荡 使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚层浮于培养液上 面时，沿管壁慢慢加入一朵试剂10滴。如有吲哚存在， 则乙醚层呈现玫瑰红色。注意：加入试剂后，不许摇 动，否则红色不明显。
（3）观察记录 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其 反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“—”表示； 如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产 酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性 反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录为“ （+）”示； 如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“（—） ”表示。
4、在糖发酵试验的培养管中装入倒置杜氏小管时，注意防止小管 内有残留气泡。灭菌时适当延长煮沸时间可除去管内气泡。
Ⅱ微生物对生物大分子的分解利用
淀粉水解试验、油脂水解试验、明胶液化试验、 石蕊牛乳试验
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ、实验目的及内容

目的：1、学习并掌握点接法接种，检测细菌能否 产生淀粉酶和利用淀粉的能力
2、检测细菌对油脂的水解能力

（三）糖发酵试验
（1）试管标记 取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 各4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌和空白对照。
（2）接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管 中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的 杜氏小管倒置放入试管中，置 37℃恒温箱中培养，分别培养24h、 48h和72h观察结果。
(2)接种：用接种环取少量的待测菌点接在培养基表面，每个平板 可以同时接种两个不同的菌种(其中一种应是枯草杆菌做对照菌)。 (3)培养：将接种后的干皿置于28℃恒温箱培养24h。
(4)检测：取出平板，打开平皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻 轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明 圈，则说明淀粉已经被水解，表示该细菌具有分解淀粉的能力。 可以用透明圈大小说明测试菌株水解淀粉能力的强弱。
实验六、细菌分解代 谢系列实验
Ⅰ细菌的生理生化反应 乙酰甲基甲醇（V.P）试验、甲基红试验、吲哚试验、糖发酵试验
一、目的与内容


目的：了解细菌鉴定中常用的主要生理 生化实验及其原理 内容：1、比较4种细菌的乙酰甲基甲醇 （V.P）试验、甲基红试验的结果 2、比较4种细菌的吲哚试验的结果 3、学会使用杜氏小管，比较4种细 菌的糖发酵试验的结果

1、淀粉水解试验
某些细菌能分泌淀粉酶（胞外酶），将淀粉水解为 麦芽糖和葡萄糖，再北细菌吸收利用。淀粉水解后 遇碘不再变为蓝色。

2、油脂水解试验
某些细菌能够分泌脂肪酶，能将培养基中的脂肪水 解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸可通过预先加 入油脂培养基中的中性红指示（指示范围为pH6.8 红—pH8.0黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时， 培养基中出现红色斑点。
三、操作步骤

（一）乙酰甲基甲醇试验与甲基红试验
（1）接种与培养：分别接大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、 枯草芽孢杆菌于装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，置于37℃ 恒温培养箱中培养24小时。 （2）结果观察：取出培养好的试管，在培养基中加入40％KoH （或NaoH）10—20滴，再加入等量的α－萘酚溶液；拔去棉塞， 用力振荡，再放入37℃恒温培养箱中培养15—30分钟。如果培 养液出现红色，则为V.P正反应。

3、吲哚试验
a、实验目的为：检测细菌代谢色氨酸产生 吲哚的能力。 b、实验原理为：某些细菌能够分解培养基 内蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚。吲哚与 对二甲基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，为 红色化合物。此为吲哚反应。

4、糖发酵试验
a、实验目的为：检测细菌利用糖类物质的能力。
b、实验原理为：绝大多数细菌都能利用糖作为炭源和 能源，但是它们在分解糖类物质的能力上是有很大的 差异的。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（乳酸、 醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳 等）；有些细菌只产酸不产气；有些细菌只产气不产 酸；还有的既产气也产酸。发酵的培养液中含有溴甲 酚紫和倒置的杜氏小管，杜氏小管中装满培养液，当 发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH＝6.8）变 为黄色（PH＝5.2），气体的产生可由倒置的杜氏小管 中有无气泡来证明
3、学习并掌握穿刺接种，了解细菌对明胶 的分解和利用的情况
4、检测细菌对牛乳的分解和利用情况

内容：1、操作细菌对淀粉的水解实验
2、比较几种细菌对油脂的水解能力
3、比较几种细菌对明胶的分解和利用 4、比较几种细菌对牛乳的分解和利用
二、实验原理

基本原理： 微生物在生长繁殖过程中，需从外界环境吸取营养物质。外界 环境中的小分子有机物可被微生物直接吸收，而大分子有机物 则不能被微生物直接吸收，它们需要经过微生物分泌的胞外酶 将其分解为小分子有机物，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶分别分 解为糖、肽、氨基酸、脂肪酸等之后，才能被微生物吸收而进 入细胞。 不同微生物分解利用大分子的能力各有不同。只有那些能产生 并分泌胞外酶的微生物才能利用大分子有机物。