2常见菌种

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诱变育种工作程序
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诱变处理后再经液体培养和不经培养的比较
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(2) 高产突变株的筛选 • 根据形态特征筛选 根据菌落和菌体（包括菌丝体、孢 根据菌落和菌体（包括菌丝体、
• • •
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长， 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能 高产和稳产所需的代谢产物。 高产和稳产所需的代谢产物。 可在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵， 可在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵， 且所需的酶活性高。 且所需的酶活性高。 生长速度和反应速度快，发酵周期短。 生长速度和反应速度快，发酵周期短。
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
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三、菌种保藏
目的: 保证菌种不发生遗传变异、 目的 保证菌种不发生遗传变异、无污染和保持 活力。 活力。 核心：人工创造条件（如低温、干燥、缺氧、 核心：人工创造条件（如低温、干燥、缺氧、和 缺乏营养物质）， ），使菌种的代谢活动处于不 缺乏营养物质），使菌种的代谢活动处于不 活动状态。 活动状态。 菌种保藏方法: 斜面低温保藏法、 菌种保藏方法 斜面低温保藏法、石蜡油封保藏 砂土保藏法、冷冻干燥法、 法、砂土保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温 冻结法
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（2）转导（transduction）育种 ）转导（ ） 由噬菌体作媒介， 由噬菌体作媒介，将一个细胞的遗传物质传递给另一 个细胞，从而获得高产变种的一种育种方法。 个细胞，从而获得高产变种的一种育种方法。 （3）接合作用（conjugation） ）接合作用（ ） 通过两种细胞直接接触将DNA从一种细胞转移到另一 从一种细胞转移到另一 通过两种细胞直接接触将 种细胞。 种细胞。 （4）原生质体融合 ）原生质体融合(protoplast fusion) 将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除， 将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除 ， 使其原生质体在高渗环境下进行融合， 使其原生质体在高渗环境下进行融合，进而使两套染色体 基因发生重组而获得高产杂交种。 基因发生重组而获得高产杂交种。
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AK:天冬氨酸激酶 天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶 高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成 调节机制
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氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、 杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌： 其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌， 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
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中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞） 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统 细胞
具有准确的转录后修饰功能； 具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。 很少分泌自身的内源蛋白。 很少分泌自身的内源蛋白
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(二) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞) 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。 具有一定的修饰蛋白的能力。
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3、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。 FDA的批准 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
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补充培养基(S.M.)：为满足特定X –需要在基本培 ：为满足特定 补充培养基 养基中补加了某种营养物质的培养基。 养基中补加了某种营养物质的培养基。 完全培养基(C.M.)：能满足各种不同X –营养要求 ：能满足各种不同 完全培养基 的培养基。 的培养基。 营养缺陷型在三种培养基上的生长情况： 营养缺陷型在三种培养基上的生长情况：
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•
根据其他生理特性筛选
A. 筛选营养突变体 营养缺陷型：指某一菌株丧失了合成某种营养物质 营养缺陷型：
的能力， 的能力，在培养基中若不外加这种营养成分就不能 正常生长的变异菌株。表示为“ 正常生长的变异菌株。表示为“X –”
基本培养基(M.M.):能满足野生型生长需要 能满足野生型生长需要 基本培养基 的培养基。 的培养基。
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4. DNA体外重组技术 vitro recombination 体外重组技术(in 体外重组技术 DNA technology)（基因工程技术） （基因工程技术） 根据需要用人工方法取得供体DNA上 上 根据需要用人工方法取得供体 的基因，在体外重组于载体DNA上，再 的基因，在体外重组于载体 上 转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译， 转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译， 表达出供体原有的遗传性状。 表达出供体原有的遗传性状。
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二、优良菌种选育
从自然界或生产中选择符合生产要求的菌种。 选种 : 从自然界或生产中选择符合生产要求的菌种。 菌种选育 育种：用人工方法引起菌种变异， 育种：用人工方法引起菌种变异，再筛选出符合生 产要求的菌种。 产要求的菌种。
（一）、菌种选育方法 ）、菌种选育方法 1.自然选育 1.自然选育 生产中根据菌种自发突变的特点进 行菌种筛选的过程。 行菌种筛选的过程。
副产物尽量少，便于提纯，以保证产品纯度。 副产物尽量少，便于提纯，以保证产品纯度。 菌种不易变异退化， 菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量 的稳定性。 的稳定性。 对于用作食品添加剂的发酵产品以及进行食品发 其生产所用菌种必须符合食品卫生要求。 酵，其生产所用菌种必须符合食品卫生要求。
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方法： 方法：1. 通过表现形态来淘汰不良菌株 2. 通过目的代谢物产量考察 3. 进行遗传基因型纯度试验 4. 传代的稳定性试验
常采用单菌落分离法。 常采用单菌落分离法。
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2.诱变育种 2.诱变育种
用各种物理、 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变 进行的筛选， 进行的筛选，称为诱变育种
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已工业化产品生产菌的介绍
1、抗生素生产有关的微生物 、 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下： 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
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3．体内基因重组育种
指重组过程发生在细胞内。即采用转化、转导、 指重组过程发生在细胞内。即采用转化、转导、接合和 原生质体融合等遗传学方法和技术， 原生质体融合等遗传学方法和技术 ， 使微生物细胞内发生 基因重组（ 染色体或基因的重新组合） 基因重组 （ 染色体或基因的重新组合 ） ， 改变遗传物质的 成分、数量和结构，从而获得优良菌株的一种育种方法。 成分、数量和结构，从而获得优良菌株的一种育种方法。 （1）转化（transformation）育种 ）转化（ ） 从供体（提供DNA的细胞） 细胞中取出遗传物质 ， 通过 的细胞） 从供体 （ 提供 的细胞 细胞中取出遗传物质， 对受体（ 获得DNA的细胞 ） 细胞的培养处理 ， 使供体的 的细胞） 对受体 （ 获得 的细胞 细胞的培养处理， DNA片段进入受体细胞内，与受体细胞的 片段进入受体细胞内， 片段进入受体细胞内 与受体细胞的DNA重新组合而 重新组合而 获得变种的一种育种方法。 获得变种的一种育种方法。
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营养缺陷型的筛选（青霉素法） 营养缺陷型的筛选（青霉素法）
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营养缺陷型的检出（影印法） 营养缺陷型的检出（影印法）
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B.筛选抗性突变体 筛选抗性突变体 抗生素抗性突变：将菌种诱变处理， 抗生素抗性突变：将菌种诱变处理，用含有某种药物 的培养基挑选抗性突变体， 的培养基挑选抗性突变体，野生的敏感菌不能在这 种培养基上生长。用梯度平板法。 种培养基上生长。用梯度平板法。 抗噬菌体菌株选育： 抗噬菌体菌株选育：诱变后用高浓度噬菌体平板筛选 抗性菌株。 抗性菌株。 条件抗性突变：温度敏感突变。 条件抗性突变：温度敏感突变。
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2、氨基酸生产有关的微生物
60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵 年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵， 50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点： 发酵工业发展历史上的一个转折点： 代谢控制发酵： 人工诱变的方法， 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 物的代谢途径，最大限度地积累产物， 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
第二章 发酵工业菌种与培养基
一、微生物的特性及发酵工业对微生物菌种的要 求 有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自 身的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
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发酵工业对微生物菌种的要求 • • •
子）的形态突变筛选可见的高产突变株。 的形态突变筛选可见的高产突变株。
• 根据代谢调节特点筛选
根据微生物的代谢调节机制来选择特定的突变体。 根据微生物的代谢调节机制来选择特定的突变体。 A. 筛选不再需要诱导物的突变体 B. 筛选抗终产物的突变体
A
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筛选抗终产物的突变体
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草芽孢杆菌 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、 淀粉酶 和地衣芽孢杆菌
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4、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌 原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、 (1977 沙门氏菌 生长迅速、蛋白产量高; 生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术. 已建立了整套表达理论及技术.
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂：
诱变剂
{
物理：紫外， 物理：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯， 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
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(1).诱变育种原理 诱变育种原理
点突变: 点突变 碱基对置换和移码 突变 染色体畸变: 在染色体上发生大的变化， 染色体畸变 在染色体上发生大的变化， 如断裂、重复、缺失、 如断裂、重复、缺失、易位和染 色体数目变 化等结构变化 。