丹参的组织培养

丹参的组织培养

一、实验目的

植物细胞和组织培养的技术性强，要求无菌操作，通过本实验可以初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解。

二、实验原理

植物体的任何一个细胞都具有生长分化成一个完整植株的能力。

三、实验材料

仪器设备

1、酒精灯、100ml三角烧瓶、9厘米培养皿

2、镊子、剪刀、高压灭菌锅

3、光照培养箱或者温室

材料和试剂

1、丹参苗、MS培养基，植物激素：NAA，6-BA，2，4-D等。

2、饱和漂白粉液（次氯酸钠）

3、75%酒精，100%酒精，酒精棉球

4、无菌水

四、实验步骤

（一）母液的配置

1、MS大量元素母液的配制

一般将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 、KNO3 ,KH2PO4 、MgSO4.7H2O 、CaCl2.2H2O的量，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至1000ml，转入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

2、MS微量元素母液的配制

一般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4 ?4H2O、ZnSO4?7H2O 、H2BO3 、NaMoO4?2H2O、CuSO4?5H2O、CoCl2?6H2O扩大100倍的量，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至1000ml，转入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

3、MS铁盐母液配制

一般将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：FeSO4?7H2O和Na2?EDTA?2H2O的量，把FeSO4?7H2O和Na2?EDTA?2H2O 分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2?EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。

4、MS有机化合物母液的配制

一般将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇、维生素B1、烟酸、甘氨酸、维生素B6的量，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

（二）植物激素的配置

常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）、6－苄氨基嘌呤（6－BA）。

1、生长素类：

（1）生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织。（2）常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA被广泛用于生根，2，4－D有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。

（3）溶解方法：用少量1mol/L NaOH或95％酒精预溶解，再加蒸馏水定容，以前者为好。（4）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

2、细胞分裂素

组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。

（1）、常用的细胞分裂素有：6－苄氨基嘌呤（6－BA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ ）

（2）、溶解方法：用少量（1ml）1mol/L HCL预溶解，再加蒸馏水定容。

（3）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

（三）培养基的制备与灭菌

1、培养基的制备

（1）将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。（2）取烧杯一个内盛200ml蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液和植物激素加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。

（3）充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为培养基要求pH值。（4）趁热把培养基分装到广口瓶中。封好瓶口。待灭菌。

2、培养基的灭菌

灭菌温度及灭菌时间：121℃（1.06kg/cm2）下灭菌20分钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121℃（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟）

（1）检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

（2）盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

（3）灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

（4）刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。

（四）无菌操作技术和接种

1、接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。（此步由专人统一负责）

2、外植体消毒：将丹参苗叶片和新鲜的茎段先用84消毒液、清水洗净，将叶片垫在灭