纳米材料固定化酶的研究进展_高启禹

・综述与专论・

2013年第6期

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

酶的固定化方法和技术研究是酶工程研究的重点之一，其核心是如何将游离的酶通过一定的方式与水不溶性的载体相结合，同时保持酶的催化活性和催化特性。固定化酶的概念自1953年由德国科学家Gubhofen ［1］提出以来，先后经过了实验室研发到工业化生产的重大转折，并建立了传统的固定化酶的基本方法，如包埋法、交联法、吸附法和共价结合法［2］。近年来，随着结构生物学、蛋白质工程及材料科学的不断发展，在酶的固定中出现了一些新型载体和新型技术，从而使酶在负载能力、酶活力和稳定性等方面获得了极大提高，且降低了酶在工农业应用中的催化成本。这些载体和技术包括交联酶聚集体、“点击”化学技术、多孔支持物和最近的以纳米粒子为基础的酶的固定化［3］。纳米材料作为

收稿日期：2012-11-27基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（112102210299），河南省教育厅自然研究计划项目（2011A180026）作者简介：高启禹，男，硕士，讲师，研究方向：酶与酶工程；E -mail ：gaog345@

纳米材料固定化酶的研究进展

高启禹1 徐光翠2 陈红丽1 周晨妍1

（1.新乡医学院生命科学技术学院 河南省遗传性疾病与分子靶向药物重点实验室培育基地，新乡 453003；

2.新乡医学院公共卫生学院，新乡 453003）

摘 要： 纳米材料在蛋白酶及核酶的固定化研究领域进展迅速，主要包括各种磁性纳米载体及非磁性纳米载体。目前在固定化纳米载体的特性、固定化方法及固定化效果上已进行了广泛探讨。综述以纳米载体的研究现状为基础，分析纳米载体固定化酶的应用前景及纳米载体固定对酶学性质的影响，并对该技术的研究进行介绍和展望。

关键词： 纳米材料 固定化酶 磁性载体 非磁性载体 核酶

Research Progress of Nanoparticles for Immobilized Enzymes

Gao Qiyu 1 Xu Guangcui 2 Chen Hongli 1 Zhou Chenyan 1

（1. College of Life Science and Technology ，Xinxiang Medical University ，Henan Key Laboratory of Hereditary Disease and Molecular Target Drug Therapy （Cultivating Base ），Xinxiang 453003；2. College of Public Health ，Xinxiang Medical University ，Xinxiang 453003）

Abstract: Immobilization of protease and ribozyme by nanometer carrier are researched as a more useful means, including of the magnetic nanoparticle and nonmagnetic nanoparticles. Currently, the types of immobilized carrier and methods and results of nanoparticles are discussed. In this paper, we describe the current application of immobilized enzyme by nanocarrier, the effect of nanoparticles matrix to enzymatic properties and the prospect of application for the above mentioned technology were introduced, and the direction of the development of nanoparticles immobilization of enzyme was analyzed.

Key words: Nanoparticle cartie Immobilized enzymes Magnetic nanoparticles Non magnetic nanoparticles Ribozyme

酶固定化的新型载体，能够体现良好的生物相容性、较大的比表面积、较小的颗粒直径、较小的扩散限制、有效提高载酶量及在溶液中能稳定存在等优点［4］。固定化的微粒状态根据纳米材料物理形态的差异性可分为纳米粒（包括纳米球、纳米囊）、纳米纤维（包括纳米管、纳米线）、纳米膜及纳米块等。目前，用于酶固定化的纳米形态以纳米粒（Nanoparticles，Nps）最为常见，纳米粒通常指粒子尺寸在1-1 000 nm 范围内的球状或囊状结构的粒子。而用于酶固定的纳米载体材料有磁性纳米载体、非磁性纳米载体等［5］。但是，在进行相关固定化设计时，仍然需严格遵循固定化酶的主要任务，即一方面要满足应用上的催化要求；另一方面又要满足在调节控制及分离上的非催化要求。

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高启禹等：纳米材料固定化酶的研究进展

1 用于酶固定化的磁性纳米载体

作为磁性纳米材料由于其良好的活性功能基团（如-OH、-COOH、-CHO、-NH和-SH等）可结合各种功能分子，因而在酶的固定化领域已获得了一定的应用（表1），同时磁性材料在生物医学（临床诊断、靶向药物和酶标）、细胞学（细胞标记和细胞分离等）和生物工程（酶的固定化）及分离工程等方面发展迅速［6］。这种应用与纳米材料的结构特性紧密相关，如表面较平滑、单分散性好、结构疏松等。除此之外，磁场能提供一种有效的酶回收的方法，可通过一定的磁力作用对具有磁性的纳米载体进行回收，从而提高了产物的纯度，避免了最终产品的

表1 磁性纳米载体在生物技术上的应用

载体 固定化酶 应用参考文献磁性SiO2纳米颗粒漆酶废水处理、生物漂白［7］Fe3O4纳米微粒胆固醇氧化酶血清中总胆固醇分析［8］Fe3O4纳米微粒脂肪酶对硝基苯磷酸二钠的水解［9］纳米磁性聚乙二醇微粒纤维素酶水解秸秆［10］Fe2O3包被的硅微粒卤烷烃脱卤素酶含脱卤素酶序列的融合蛋白质的生产［11］AlN（氮化铝）纳米颗粒β-葡萄糖苷酶纤维素的降解、食品风味的改善［12］ZnO纳米微粒β-半乳糖苷酶乳糖水解［13］离子液体修饰的超顺Fe3O4磁性纳米颗粒青霉素G酰化酶催化青霉素G分解为6APA和苯乙酸［14］

酶污染。

采用磁性纳米载体进行酶的固定对酶的酶活力和稳定性、酶结构和功能、酶特异性等酶学性质有一定的提高，但在生物催化过程中需充分考虑生物催化剂的回收利用、经济效益及副产物的处置等，以达到最优的固定化设计。Wang等［15］ 通过共沉淀法对Fe3O4纳米粒子进行了表面不同链长度的烷基硅烷的修饰，获得了改性的Fe3O4粒子，通过对脂肪酶的固定发现，固定化酶的活性及稳定性与增加烷基链的长度有关。Sachin等［16］用新型磁性交联的CLEAs颗粒固定了α-淀粉酶，研究发现α-淀粉酶被固定化后，其对底物的亲和力得到增强，同时也提高了酶的热稳定性和贮存稳定性，即使在贮存42 d 后仍能保持近100％的酶活。Zhang等［17］成功地将腺苷脱氨酶固定在金纳米（AuNP）微粒上，并用标记检测证实了二者的连接。动力学研究表明，AuNP 固定的腺苷脱氨酶仍具有较好的稳定性和催化活性。Natalia等［18］探讨了利用聚合有聚乙二醇的Fe3O4磁性纳米粒子固定α-半乳糖苷酶的固定化效果。研究发现，酶与载体进行了有效的偶联，但偶联效率受纳米粒子直径大小等理化性质的影响，同时在酶的热稳定性上得到了提高。Gardimalla等［19］研究了固定在Fe2O3磁性纳米微粒上的假丝酵母脂肪酶在稳定性方面的改变，结果发现，采用Fe2O3磁性纳米微粒固定脂肪酶可以获得比游离酶更长的可重复利用时间。Hong等［20］发现在空间位阻和静电的共同作用下，结合在表面修饰的纳米金颗粒表面的α-胰凝乳蛋白酶对携带正电荷的底物表现出很强的亲和性，同时具有较高的催化活力，而对携带负电荷的底物仅表现很低的亲和力和催化活力，对中性底物的亲和力和催化能力居中。

2 非磁性纳米载体上酶的固定化

非磁性纳米载体通常由天然高分子材料和人工合成高分子材料制备，目前最常用的方法是利用反胶团进行聚合反应从而制备纳米级高分子载体，然后再通过共价交联或吸附的方法对酶进行固定化［21］。根据高分子材料的性质可将其分为无机纳米载体、有机纳米载体和复合物纳米载体等［22］。非磁性材料的磁电阻效应一般都比较低，因此在特殊的环境中能为酶的应用提供相对容易的调控，而且作为纳米级的生物催化体系，在表面积/体积比上具有独一无二的天然优势。目前，采用非磁性纳米载体进行酶的固定已取得了系列研究成果（表2），同时随着材料科学的进一步发展，必将有更多的新材料被应用于酶的固定化。

使用非磁性纳米载体进行酶的固定前需用傅利