临床免疫学检验 课件 第18章 补体的检测及应用

（二）CH50测定方法
1.红细胞浓度的调整
绵羊红细胞（ SRBC ）采自绵羊颈静脉，制备脱纤 维羊血或用阿氏（ Alsever ）血液保存液制成抗凝血， 4℃保存备用 。使用前，调制成 2% ～5% SRBC 悬液。 为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液， 加入20～30倍的稀释液，在 542nm 波长处测定吸光值 以调整红细胞浓度。
C1IN 150 α
180
H
C4 180 β2 430~600 C4bp 1100
250
C5 190 β2 C6 128 β2 C7 120 β2
75
I因子来自百度文库93
β
50
60
H因子 159 β 400~480
55
S因子 88
α
500
C8 163 γ1
200
二、补体的活化途径
经典途径
图意示径途活激条三统系体补
经典激活途径
替代激活途径
MBL途径
激活物质 起始分子 参与补体成分 所需离子 C3转化酶 C5转化酶
生物学作用
抗原抗体复合物
C1q
C1、C4、C2、C3、C5-C9
Ca2+、Mg2+ C4b2a
C4b2a3b
参与特异性免疫的 效应阶段,感染后期
发挥作用
肽聚糖、酵母多糖、脂多糖
C3
C3、C5-C9、B因子、D因子
? 补体含量与活性的测定，对机体免疫状态的 评价和疾病的诊断具有重要意义。
一、 补体的理化特性与生物学功能
分类
根据补体系统的生物学功能，可将其分为： 补 体固有成分、补体调节蛋白、补体受体 (complement receptor, CR) 三大部分 。
补体理化性质
? 由肝细胞、巨噬细胞 以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生 均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属 β球蛋白 ?含量约占血清球蛋白总量的10% ，其中C3含量最高、D因
补体 成分
分子量
电泳 区带
血清含量参 考值
（μg/ml ）
补体 成分
分子量
电泳 区带
血清含量参 考值
（μg/ml ）
C1q 390 γ2
70
C9
79
α
240
C1r 95
β
35
B
95
β 210~240
C1s 85
α
35
D
25
α
2
C2 117 β1 20~30
P
220 γ2
25
C3 190 β1
1300
子含量最低 ?固有成份间的分子量差异较大，其中C1q 最大、D因子最小。 ? 不同种属中补体含量不同，豚鼠血清中含量丰富（实验室补 体来源）
? 稳定性： ?对热不稳定，56°C、30min 即被灭活，0～10 °C条件下 活性只能保持3～4d 。 ?多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加 剂等均可破坏补体
一 CP-CH50测定法的原理
? （一）实验原理 ?补体最主要的活性是 溶细胞作用 ，这种活性很 容易通过 溶血反应 进行 检测。补体能使溶血素特 异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红 细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相 关（ sRBC- 溶血素激活补体，导致靶细胞溶解）。 ?在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应 对补体的剂量依赖呈一个特殊的 S形曲线。
?在轻微溶血和接近完全 溶血时，补体量的变化对 溶血程度的影响不大，即 溶血对补体量的依赖不敏 感。 ?但在30％～70%溶血时， S曲线最抖，补体含量出 现少许变动，会造成溶血 程度较大的改变 ，此阶段 对补体量的变化非常敏感。
溶血程度与补体含量的关系
? 故采用50％溶血作为终点指标要比100％溶血敏 感得多，这一方法称为补体50％溶血 (complement hemolysis 50％)，简称为CH50
3.稀释缓冲液 ：PBS(适量钙和镁离子） 4. 50%溶血标准管：2%SRBC 0.5ml+蒸馏 水2.0ml,完全溶血。再加2.5ml缓冲液则 为50%溶血 5. 50%溶血总补体值的计算 CH50(U/ml)=(1/终点管稀释血清的用量） ×稀释倍数
2.溶血素滴定
?溶血素可通过 SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化 ?试验前需先行加热 56℃ 30min或60℃ 3min 以灭活补 体 ?溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用 ?自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补 体活性测定中， 大多使用 2个单位。 ?溶血素效价稳定，一般使用 3个月后再作重新滴定
第十七章 补体检测及应用
第一节 补体的理化特性及生物学功能 第二节 血清总补体活性测定 第三节 单个补体成分的测定 第四节 补体参与的试验 第五节 补体测定的临床意义
思考与小结
第一节 概 述
补体：
?人和脊椎动物血清，具有 酶样活性、 不耐热 的糖蛋白
? 其存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人 血清中含量相对稳定，某些疾病时，含量及 其活性可发生改变。
Mg2+ C3bBb C3bnBb
参与非特异性免疫的 效应阶段,感染早期
发挥作用
MBL相关的丝氨酸蛋白酶
C2、C4
C2-C9、 MASP
Ca2+ C4b2a C4b2a3b
参与非特异性免疫的 效应阶段,感染早期
发挥作用
补体的生物学功能
1.溶解细胞、细菌和病毒：抗原抗体复合物激活补体,形成攻膜复合 体，导致靶细胞裂解，介导特异和非特异免疫应答，发挥免疫防御 与损伤双层作用。
2.调理作用：细菌-Ag-Ab-补体片段（C3b\4b\iC3b等）-中性粒细 胞或吞噬细胞补体受体结合，介导吞噬。
3.引起炎症反应:补体产生C3a\4a\5a等过敏毒素，使肥大细胞和嗜 碱细胞脱颗粒，释放组氨等生物活性介质，增加血管通透性和平滑 肌收缩，同时介导吞噬细胞的向炎症部位趋化，引起炎症反应。
4.清除免疫复合物：中等 IC沉积血管壁，引起组织损伤。 ?改变Ig的空间结构，抑制其结合新的抗原表位，抑制形 成新的IC；另一方面空间干扰 IgFc段的相互作用，促进 复合物溶解； ? Ag-Ab- 补体 -表达 C3b 受体 -靶细胞（红细胞、血小板）， 血液运送至肝脏，较大复合物遭清除。
5.免疫调节作用： ADCC,C3固定抗原，易被 APC处理， 补体C3d与BCR结合，介导 B的活化，并增殖为浆细胞
第二节 补体总活性测定
? 血清总补体活性测定可反映补体的整体功能，是以红细胞 的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50（50% complement hemolysis) ? 补体活化途径不同，应用不同的激活物可活化不同的补体 途径
?基于经典途径的CP-CH50（临床常规项目） ?脂质体均相免疫溶解试验 ?应用于C3旁路检测的AP-CH50（尚未列入检验常规）