基因操作主要技术原理
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
electrophoresis，PFGE)
3.DNA核苷酸序列分析
➢Sanger双脱氧链终止法
基本原理 Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法
➢ Maxam-Gilbert化学修饰法
基本原理
➢ 两种测序方法的比较 ➢ DNA序列分析的自动化
4.核酸分子杂交
▪ 基本原理 ▪ 用途:
DNA/DNA的杂交,可用于检测特定生物之 间是否存在着亲缘关系; DNA/RNA的杂交,可揭示核酸片段中某一 特定基因的位置
▪ 实验步骤:
核酸印迹转移
Southern blotting diagram
Northern blotting
电泳凝胶核酸印迹法
斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)
菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque
blotting)
印记杂交
5.细菌转化(transformation)
表面的电荷特性，使得细胞容易吸收 DNA/质粒，在等渗溶 液中使转化Baidu Nhomakorabea再生。
➢ ③ 电转化（电穿孔法): 其原理是用高压脉冲电流击破细胞 膜或形成小孔，使得DNA大分子进入细胞。当电场强度、脉 冲强度以一定的组合造成细胞50-75%的死亡率时，转化水 平最高，转化率是人工制备感受态细胞转化率的10-20倍。
Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA B:1944
2.核酸凝胶电泳
gel electrophoresis
▪ 基本原理 电泳迁移率 凝胶的分辨能力 溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)
▪ 用途: 可用于分离、鉴定、纯化DNA ▪ 脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel
▪ 基本原理 diagram 感受态(competence)出现的机制
▪ 过程 ▪ 用途: 是获得新的遗传性状的一种手段，是微
生物遗传、分子遗传、基因工程等领域的基 本实验技术
▪ 人工诱导感受态的方法:
➢ ① 利用Ca2+和改变温度的方法，这在大肠杆菌中常用到。 ➢ ② PEG介导的转化：利用聚乙二醇（PEG）改变原生质体
➢ ④ Biolistic(基因枪)转化 : 将包裹有DNA的钨粒象子弹一样 高压射入细胞或细胞器。
Thank you for your attention
▪ 基因扩增的定义 ▪ PCR技术的基本原理和特点 ▪ 影响因素 ▪ PCR技术的研究应用 ▪ PCR扩增效率的指标：
有效性、特异性、忠实性
The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry" "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
基因操作主要技术原理
basic principles of gene manipulation
目的基因的表达
▪ 制备大量目的基因片段
PCR
▪ 重组DNA
鉴定目的基因 (凝胶电泳、测序、核酸杂交)
转化
▪ 宿主细胞
抗生素筛选，或蓝白斑筛选
▪ 重组子的筛选
▪ 表达蛋白的收集，纯化
1.基因扩增gene amplification
3.DNA核苷酸序列分析
➢Sanger双脱氧链终止法
基本原理 Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法
➢ Maxam-Gilbert化学修饰法
基本原理
➢ 两种测序方法的比较 ➢ DNA序列分析的自动化
4.核酸分子杂交
▪ 基本原理 ▪ 用途:
DNA/DNA的杂交,可用于检测特定生物之 间是否存在着亲缘关系; DNA/RNA的杂交,可揭示核酸片段中某一 特定基因的位置
▪ 实验步骤:
核酸印迹转移
Southern blotting diagram
Northern blotting
电泳凝胶核酸印迹法
斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)
菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque
blotting)
印记杂交
5.细菌转化(transformation)
表面的电荷特性，使得细胞容易吸收 DNA/质粒，在等渗溶 液中使转化Baidu Nhomakorabea再生。
➢ ③ 电转化（电穿孔法): 其原理是用高压脉冲电流击破细胞 膜或形成小孔，使得DNA大分子进入细胞。当电场强度、脉 冲强度以一定的组合造成细胞50-75%的死亡率时，转化水 平最高，转化率是人工制备感受态细胞转化率的10-20倍。
Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA B:1944
2.核酸凝胶电泳
gel electrophoresis
▪ 基本原理 电泳迁移率 凝胶的分辨能力 溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)
▪ 用途: 可用于分离、鉴定、纯化DNA ▪ 脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel
▪ 基本原理 diagram 感受态(competence)出现的机制
▪ 过程 ▪ 用途: 是获得新的遗传性状的一种手段，是微
生物遗传、分子遗传、基因工程等领域的基 本实验技术
▪ 人工诱导感受态的方法:
➢ ① 利用Ca2+和改变温度的方法，这在大肠杆菌中常用到。 ➢ ② PEG介导的转化：利用聚乙二醇（PEG）改变原生质体
➢ ④ Biolistic(基因枪)转化 : 将包裹有DNA的钨粒象子弹一样 高压射入细胞或细胞器。
Thank you for your attention
▪ 基因扩增的定义 ▪ PCR技术的基本原理和特点 ▪ 影响因素 ▪ PCR技术的研究应用 ▪ PCR扩增效率的指标：
有效性、特异性、忠实性
The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry" "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
基因操作主要技术原理
basic principles of gene manipulation
目的基因的表达
▪ 制备大量目的基因片段
PCR
▪ 重组DNA
鉴定目的基因 (凝胶电泳、测序、核酸杂交)
转化
▪ 宿主细胞
抗生素筛选，或蓝白斑筛选
▪ 重组子的筛选
▪ 表达蛋白的收集，纯化
1.基因扩增gene amplification