感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一．菌液OD值偏大或偏小二．原始菌株不好三．试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；7．一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比；4．为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
感受态细胞制备实验报告
感受态细胞制备实验报告感受态细胞制备实验报告细胞是生物体的基本结构和功能单位，它们通过不同的形态和功能，构成了我们身体的各个组织和器官。
在细胞中，有一类特殊的细胞被称为感受态细胞，它们具有感知和传递外界刺激的能力。
本次实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在生物学研究中的应用。
实验一：感受态细胞的制备方法感受态细胞的制备是一项复杂的过程，需要精确的实验操作和合适的培养条件。
首先，我们需要选择合适的细胞系作为实验对象。
常用的感受态细胞包括神经元、心肌细胞和肌肉细胞等。
在本次实验中，我们选择了人类胚胎干细胞作为研究对象。
首先，我们需要将胚胎干细胞培养至适当的生长状态。
胚胎干细胞具有多向分化的潜能，可以分化为各种不同类型的细胞。
在培养过程中，我们需要提供适当的培养基和生长因子，以促进细胞的增殖和分化。
接下来，我们将利用特定的诱导因子来诱导胚胎干细胞向感受态细胞方向分化。
这一步骤是实验中最关键的一步，需要精确控制诱导因子的浓度和时间。
通过适当的处理，胚胎干细胞将逐渐转变为感受态细胞。
最后，我们需要对所制备的感受态细胞进行鉴定和分析。
常用的方法包括免疫荧光染色、基因表达分析和电生理实验等。
这些方法可以帮助我们确定细胞的特征和功能，从而验证制备的感受态细胞的准确性和可行性。
实验二：感受态细胞在生物学研究中的应用感受态细胞在生物学研究中具有广泛的应用前景。
首先，感受态细胞可以用于研究神经系统的发育和功能。
通过制备不同类型的感受态细胞，我们可以模拟和研究神经系统中各种生理和病理过程，如神经元的迁移、突触形成和神经传导等。
其次，感受态细胞还可以用于药物筛选和毒性测试。
通过将药物或化合物作用于感受态细胞，我们可以评估其对细胞的影响和作用机制。
这有助于加速新药的开发和毒性的评估，为药物研发提供重要的参考依据。
此外，感受态细胞还可以应用于组织工程学和再生医学研究。
通过将感受态细胞与支架材料结合，可以构建出具有特定功能和结构的人工组织。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理是通过采用特定的培养条件和处理方法，使细胞转变为感受态细胞。
感受态细胞与其它类型的细胞相比，具有更特殊的功能和形态。
首先，制备感受态细胞通常需要选择合适的细胞系或细胞株作为起始材料。
这些细胞通常具有一定的可塑性和多能性，可以通过适当的诱导和处理转变为感受态细胞。
其次，制备感受态细胞需要提供一系列的培养条件，以满足细胞生长和分化的需要。
这包括提供适当的培养基组成、生长因子、细胞外基质支持等。
适当的培养条件可以促进细胞内信号传导途径的激活，从而触发感受态细胞的形成。
另外，制备感受态细胞的过程中还需要使用一些特定的诱导因子或化合物。
这些诱导因子可以通过激活或抑制特定的信号通路，调节细胞的基因表达和功能，从而诱导细胞转变为感受态细胞。
最后，制备感受态细胞还需要进行一系列的分析和鉴定，以确定细胞是否成功转化为目标细胞。
这包括检测特定标志物的表达、观察细胞形态学的改变、进行功能性实验等。
总之，制备感受态细胞的原理是通过选择合适的起始材料、提供适宜的培养条件、使用特定的诱导因子以及进行分析鉴定等步骤，将细胞转变为目标的感受态细胞。
这个过程涉及到多个层面的调控和影响，需要综合考虑细胞的内外环境因素。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞，听起来像是个高大上的名词，其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。
想象一下，像个随时待命的服务员，时刻准备接待客人。
细胞的这种状态，通常是在特定的环境下，通过某些方法处理后形成的。
1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢？这可是生物实验中的关键一步！它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究，甚至是药物开发。
就像一个关键的道具，缺了它，很多实验都没法顺利进行。
2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂，简单来说就是要让细胞放松心情，准备好接受外来的DNA。
首先，我们需要把细胞放在一个低温环境下，这就像给它们一个凉爽的SPA，让它们变得“懒洋洋”的。
接着，添加一些化学试剂，比如氯化钙，这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA，哇，真是神奇！2.2 处理时间然后，细胞要在这个特殊的环境中待一段时间，让它们完全“感受”这个过程。
通常，我们会让它们静置一小时左右，这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍，兴奋而又期待。
当时间到了，嘿！细胞已经准备好迎接挑战了。
3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域，感受态细胞的应用真是无处不在。
比如，科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中，看看它们会发生什么样的变化。
就像给一个平凡的角色增加超能力，结果往往出乎意料，有时候能发现新的疾病机制，有时候能找到新的治疗方法，简直就是科研的“黑科技”！3.2 工业应用当然，感受态细胞的应用不仅限于实验室，它们在工业上也大显身手。
比如，利用这些细胞生产蛋白质，甚至是药物，提升生产效率，降低成本，简直是企业的“秘密武器”。
有了它，企业就能在竞争中抢占先机，像个抢眼的明星一样脱颖而出。
总之，感受态细胞的制备虽然听起来复杂，但只要掌握了窍门，便能游刃有余。
它不仅是生物学研究的基础，更是现代科技进步的重要推动力。
就像一首动听的乐曲，细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备及各种感受态的特点Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法：1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。
注意：接种比例不得大于1:10。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃ 5000g离心5分钟。
用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。
分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
含15%甘油的L CaCl2制备方法:称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。
感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
感受态细胞制备实验报告
感受态细胞制备实验报告摘要本实验旨在探究感受态细胞的制备方法。
通过一系列步骤，我们成功地制备出感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
实验结果表明，我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。
介绍感受态细胞是一种具有感受外界刺激并做出相应反应的细胞。
在生物学研究中，制备感受态细胞是一项重要的实验工作。
本文将详细介绍感受态细胞的制备方法，并通过实验证实其有效性。
实验材料和方法材料•细胞培养基•细胞培养器具（培养皿、离心管等）•细胞培养箱•细胞染色剂方法1.细胞培养基的制备：–将适量的细胞培养基粉末加入无菌蒸馏水中，并充分搅拌溶解。
–调整pH值至合适范围。
–通过过滤器过滤，获得无菌的细胞培养基。
2.细胞的预处理：–选择适宜的细胞系，如人类上皮细胞系。
–将细胞培养在培养皿中，以适宜的温度和湿度进行培养。
–在细胞生长到合适密度时，进行下一步操作。
3.细胞的感受态诱导：–将培养皿中的细胞用无菌PBS缓冲液洗涤一次，以去除培养基中的成分。
–加入含有感受态诱导剂的培养基。
–将培养皿置于细胞培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间。
4.细胞的染色实验：–取出培养皿中的细胞，用PBS缓冲液洗涤去除培养基。
–按照染色剂使用说明，加入合适浓度的染色剂。
–在暗处孵育一定时间，使细胞充分染色。
–用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除多余的染色剂。
–观察细胞染色情况，使用显微镜拍摄图像。
结果与讨论经过以上步骤，我们成功地制备了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
观察到染色后的细胞明显显示出感受态特征，与对照组相比，表现出明显的区别。
这说明我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。
通过本实验，我们对感受态细胞的制备方法有了更深入的了解。
然而，还需要进一步的研究来探究感受态细胞的特性以及其在生物学研究中的应用。
此外，我们也可以尝试其他方法来制备感受态细胞，以寻求更高效的制备方法。
结论本实验通过一系列步骤成功地制备出了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。
感受态细胞制备
感受态细胞制备
感受态细胞制备是一种技术，用于制备仅有一种特定细胞类型的
细胞株。
常用于生物医学研究中，其中包括肿瘤学、免疫学研究等等。
细胞的感受态是指把转录因子的活性形式改变，使其响应环境刺激，
以调节其生化活性或特性。
感受态细胞制备的基本步骤是，首先收集需要制备的细胞株。
此外，设计环境因子，使细胞可以被富集于细胞培养液中，比如添加一
定量的表观遗传因子。
然后，将细胞培养液中的收集细胞用多种组合
方法，如离心法、细胞膜滤过法提纯细胞，最终得到所需的细胞株。
最后，移植所筛选出来的细胞株到环境中，使其进入感受态。
模
拟能够调节受体活性的外界刺激，对其进行诱导，使其进化到更加完
美的感受态细胞。
当准备好后，可以用于临床诊断、研究以及各种免
疫应答的研究等。
无论是医学上的准备，还是科学研究的准备，感受态细胞的制备
都是非常重要的。
人们可以通过改变细胞生长环境，调节外源基因活性，来改变细胞表达，以及形态和功能等，从而有效地控制细胞的生
长和发育。
超级感受态细胞(大肠杆菌)-原理和制备Protocol
大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。
一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。
转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。
Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。
cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
制备感受态细胞的原理和方法
制备感受态细胞的原理和方法1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
二原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
各类感受态细胞的区别用途和特点
各类感受态细胞的区别、用途和特点Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。
特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。
用途：分子克隆和质粒提取。
BL21(DE3)菌株基因型：F–ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。
特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。
T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合于非毒性蛋白的表达。
用途：蛋白质表达。
[生物秀-专心做生物菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。
特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。
此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。
适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。
用途：蛋白质表达Competent E. coliFull Product Description BL21 Star™ E. coli strains are high-performance BL21 hosts designed for improving protein yield in a T7 promoter-based expression system. Because T7 RNA polymerase synthesizes mRNA more rapidly than E. coli RNA polymerases, transcription from the T7 promoter is uncoupled to translation in E. coli. This results in mRNA transcripts unprotected by ribosomes, which are then subject to enzymatic degradation by endogenous RNases (1). The reduced level of transcriptsin the cell often leads to greatly reduced levels of protein yield (Figure1). The BL21 Star™ strains contain a mutation in the gene encoding RNaseE (rne131), which is one of the major sources of this mRNA degrada tion (2). BL21 Star™ cells significantly improve the stability of mRNA transcripts and increase protein expression yield from T7promoter-based vectors (3) (Figure 2).BL21 Star™(DE3) is ideal for expressing proteins that are non-toxic to E. coli.BL21 Star™(DE3)pLysS offers lower basal-level expression of heterologous genes than BL21 Star™(DE3). It is designed for expressing proteins that are slightly growth inhibitive to E. coli.DH5α菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–特点：一种经常使用于质粒克隆的菌株。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态，可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。
以下是一种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 培养细胞：选择需要研究的感受态细胞类型，如神经元、免疫细胞等，在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。
2. 刺激处理：给予细胞一定的外界刺激，如药物、光刺激、温度变化等。
刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。
3. 收集细胞：在刺激处理后，收集细胞，可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。
4. 提取RNA或蛋白质：利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质，用于后续分析。
5. 分析感受态：通过各种分析方法，如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。
感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异，因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
（写作参考：）。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
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感受态细胞制备
制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:
1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;
Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等
5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;
6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:
称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征
感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:
(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
(3)受体细胞得修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入得ＤＮA分子不易被切除或破坏、
实验室常用得感受态细胞
1。
DH5α菌株ﻫ克隆菌株:DH5α就是一种常用于质粒克隆与高拷贝质粒得稳定复制得菌株。
E、ｃoli ＤH5α在使用pＵC系列质粒载体转化时,其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码得β—半乳糖苷酶氨基端实现α－互补,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株、ReｃA１与ｅｎd A1得突变有利于克隆DNA得稳定与高纯度质粒DＮA得提取。
基因型:F－、φ80dｌaｃＺΔM15、Δ(ｌacZYA-argF)U169、deoR、reｃＡ1、eｎdＡ1、ｈs ｄR１7(ｒk—,ｍk+)、pｈoA、ｓｕpE44、λ—、ｔhｉ—1、gyｒA９6、relA1
2。
TOP10菌株ﻫ克隆菌株:该菌株适用于高效得DNA克隆与质粒扩增,能保证高拷贝质粒得稳定遗传。
ﻫ基因型:F－、ｍcrＡΔ(ｍrr－hsdＲMＳ—mcrＢC)、φ80 、laｃＺΔM15、△l ａｃⅩ74、reｃA1、araΔ1３9Δ(aｒａ—lｅu)７６９7、ｇalU 、gａｌK 、rｐｓ、(S ｔrｒ) enｄA1、ｎupG
3。
BL21(DE3) 菌株:
蛋白表达菌株:该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子得表达载体(如ｐET系列)得基因。
该菌株用于Ｔ7 RNA聚合酶为表达系统得高效外源基因得蛋白表达宿主,T7噬菌体RNA聚合酶基因得表达受控于λ噬菌体DE3区得acＵV5启动子,该区整合于BＬ２1得染色体上。
该菌株适合于非毒性蛋白得表达、
基因型:F－、ompT、hsdＳ(ｒB-ｍB—)、ｇａl、ｄｃm(DE3)
4。
BL２１(DＥ３) pLysＳ菌株ﻫ蛋白表达菌株:该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。
ＰLｙsS含有表达T７溶菌酶得基因,能够降低目得基因得背景表达水平,但不干扰目得蛋白得表达。
该菌适合表达毒性蛋白与非毒性蛋白。
基因型:Ｆ—、ｏmpT、hsdS(r B-m B—)、gａl、ｄcm(DE３)、pLyｓＳ、Ｃamr
５、Rocetta感受态特征:
蛋白表达菌株
Rosetta系列菌株来源于BL２1系列宿主菌,该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少得真核细胞密码子,增加了真核细胞得蛋白表达水平。
（1）Rocetta (ＤE3)
该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏得６种稀有密码子(AUＡ、AGＧ、AGA、ＣUA、CＣＣ、GGA)对应得tRNA,这样Ｒｏcetta菌株提供了“万能”得翻译,从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致得表达限制,提高外源基因尤其就是真核基因在原核系统中得表达水平。
ｔRNA基因由它们得天然启动子驱动。
基因型: F- 、oｍpT、hsｄSB (r B －m B － )、gal、ｄcm、lacY1(DＥ3)、pRARＥ(aｒｇU,argW,
ｉleX,glｙT,leuW,ｐrｏL)(Ｃｍｒ )
补充:稀有密码子对蛋白表达得影响:数氨基酸都有一个以上得密码子,对Ｅ.coli密码子应用情况分析表明一些密码子很少使用,尤其就是精氨酸密码子AＧA, ＡＧG , ＣGG ,CGＡ;异亮氨酸得密码子AUA;亮氨酸得密码子CUA与甘氨酸得密码子GGA与脯氨酸得密码子ＣＣＣ很少被用到。
目得基因中含有过多得稀有密码子被认为就是低表达水平与产生不完全产物得一个原因、当在氨基端附近出现多个稀有密码子得时候,情况更为严重,许多研究表明,精氨酸得密码子AGA与AGG得高频出现可能大大影响蛋白得产量、当这些密码子出现在N－端附近时候,这种影响将达到最大。
ﻫ多个实验室报道,在宿主菌中增加同类tRＮＡ时那些含有稀有密码子基因得蛋白产量将大大提高。
RoｓｅttaTＭ菌株可以增加精氨酸稀有密码子AGG 与AGA,异亮氨酸得密码子AＵA;亮氨酸得密码子CＵA与甘氨酸得密码子GＧA与脯氨酸得密码子CCC。
因此,很适合用于表达那些含E.ｃoｌi稀有密码子基因得目得蛋白、
(引用自网址)
(２)Roseｔta 2 (DE3) pＬySs来源于Rosetta(DE３),本菌株含有pRARE2质粒,除了能够提供原Rｏsetta(DE3)宿主菌含有AＵＡ, AGＧ,AGA, CUA, CCC, 与GGA六个稀有密码子得tRNA外,还提供了第七个稀有密码子ＣGG得tRNA、同时,pＲＡRE2质粒具有氯霉素抗性。
Roseｔta2(ＤE3)pLySs载体通过提供稀有密码子,使得该宿主菌相对于其她大肠杆菌,能够提供更加“通用”得蛋白质表达,从而提升目得蛋白表达水平。
ＤE3就是溶源性得λＤＥ3,所以带有T7RNA聚合酶得染色体拷贝、该菌株适用于pＥＴ系列载体,及其她T7启动子系列载体。
含有ｐＬSｓ质粒,pLyＳs质粒能够产生Ｔ7溶菌酶,可以有效降低目得基因得基础表达水平。
pＬySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。
pＬySs质粒得起始复制位点就是p15 Oｒigｉｎ,这使得该质粒能够与ｐUC－及pBR３２2－衍生得质粒互相共存。
转化
1、转化得原理:溶液中得Ｃa离子与细菌细胞膜结合,在低温下形成液晶结构,在４2℃,9０
ｓ热激下,这种液晶结构收缩,将细胞膜扯开孔道,使DＮA进入细菌细胞中、
2、转化得步骤:
(1)取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化得细胞悬液分装到无菌预冷得离心管中,置于冰浴中、
（2）向感受态细胞中加入目得DNＡ(5０ｕl感受态细胞能够被１nｇ超螺旋ＤNA所饱与),轻弹混匀,在冰浴中静置３0miｎ;
注意:一次转化感受态细胞得建议用量为５0ul,可以根据实际情况分装使用,应注意所用DNＡ体积不能超过感受态细胞悬液体积
得十分之一,也有说法就是不能超过５%。
不能加入太多DＮA,会影响转化效率,体积不能超过10ｕl,所以连接时做10ｕｌ连接体系可用一半做转化,剩下得放在４°C、
(３)将离心管置于４２度水浴中放置９０ｓ,然后快速转移到冰浴中,使细胞冷却2—3miｎ(一般2ｍｉｎ),该过程不要摇动离心管;
(4)向每个离心管中加入500ｕｌ无菌得LB培养基(不含抗生素),混匀后置于3７度摇床震荡培养４5min(15０rpm),目得就是使质粒上相关得抗性标记基因表达,使菌体复苏。
(5)将离心管内容物混匀,可吸取适量(可吸取20０-30０ul,也可据情况而定)转化产物涂布平板,而如果预计得克隆较少,可通过离心(400０rpm,2mｉn)后,吸掉部分上清,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。
注意:涂布剩余得菌液可置于４度保存,如果次日得转化菌落过少可以将剩下得菌液再涂布新得培养板。
2、转化得注意事项:
(1)感受态细胞需放置于－７0°C,不可冻融与放置时间过长,以避免降低感受态细胞得转化效率;
(2)进行转化操作时,应根据相应温度与无菌操作得要求进行,尽量在超净台操作;
(3)为防止转化实验不成功,可以保存部分连接反应液,以重新转化,将损失降到最低、。