双水相萃取全解
双水相萃取的原理及应用 (2)
双水相萃取的原理及应用1. 引言双水相萃取是一种常用的分离和提取技术，它利用两种不相溶的溶剂，即水相和有机相，在液-液界面上进行分相和萃取。
该技术具有高效、简便、环保等特点，被广泛应用于化学、生物、环境等领域。
本文将介绍双水相萃取的原理和一些常见的应用。
2. 双水相萃取的原理双水相萃取的原理基于不同溶剂之间的亲疏水性差异，以及化合物在两种溶剂中的分配系数。
在水相和有机相的界面上，亲水性较强的化合物会向水相转移，而亲水性较弱的化合物则会向有机相转移。
这样，在两相之间可实现化合物的分离和富集。
3. 双水相萃取的步骤双水相萃取通常包括以下几个步骤：•第一步：选择合适的水相和有机相溶剂。
一般情况下，水相为水，有机相为有机溶剂如乙醚、丙酮等；•第二步：将待提取物溶解在适量的水相溶液中，并加入适量的有机相溶液；•第三步：进行充分摇匀和混合，使两相形成均匀混合体；•第四步：静置一段时间，使两相分离，从而形成上下两层液相；•第五步：将两相分离，分别收集上下相中的物质。
4. 双水相萃取的应用4.1. 生物化学•蛋白质分离纯化：双水相萃取可用于蛋白质的富集和纯化，对于分子量较大的蛋白质特别有效；•酶的富集：通过双水相萃取，可以有效地从复杂的酶混合物中富集目标酶，提高其活性和纯度；•生物活性物质的提取：双水相萃取可用于提取天然产物中的生物活性物质，如草药提取液中的有效成分。
4.2. 环境科学•水样前处理：对于含有大量有机物的水样，双水相萃取能够有效地去除有机物，净化水质；•环境污染物的富集：通过双水相萃取，可以将水中微量的有机污染物富集到有机相中，方便进一步分析和检测。
4.3. 化学合成•有机合成中的分离提取：在化学合成过程中，双水相萃取可用于分离和富集目标化合物，提高产率和纯度。
5. 结论双水相萃取是一种高效、简便、环保的分离和提取技术，适用于多个领域。
它的原理基于不同溶剂之间的亲疏水性差异，通过分配系数的差异实现化合物的分离和富集。
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
双水相萃取全解
( aqueous two-phase extraction )
主要内容：
一、双水相萃取的基本理论 二、双水相萃取工艺流程操作
三、影响双水相的因素
四、双水相萃取的应用 五、双水相萃取技术的发展
前 言
• 双水相萃取现象最早是1896年由Bei jerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的， 这种现象被称为聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。 • 20 世纪 60 年代瑞典 Lund 大学的 Albertsson P A及其同事们最先提出双水相萃取技术并做 了大量的工作。 • 70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等 人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中 提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取 效果。
R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK， Y=（1+1／RK）-1 ×100％ 式中：R－相比；Vb－下相体积，mL； Vt－上相体积，mL； K－分配系数； Cb－下相溶质的质量浓度，g／mL； Ct －上相溶质的质量浓度，g／mL； G－上、下相溶质的质量比； Y－萃取率，％。
(3) 双水相相图制作
① 聚合物∕聚合物ห้องสมุดไป่ตู้水相
当2种聚合物混合时，由于2种聚合物 间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无 法相互渗透，不能形成均一相，故达到平 衡后形成两相，这2种聚合物分别位于互 不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物 双水相体系。
聚合物双水相形成机理
两种聚合物 相互混合 体系熵的增加 两个因素 混合 分离（聚合物的不相容性） 分子间作用力
6）无机盐的浓度
盐的正、负离子在两相间分配系数不 同，两相间形成电位差，从而影响带电 生物大分子的分配。无机盐浓度的不同 能改变两相间的电位差。
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
双水相萃取名词解释
双水相萃取名词解释双水相萃取是一种分离和提取物质的物理化学方法，它基于物质在两种不相溶的水相中的分配差异来实现。
其中，一相为有机溶剂相，另一相为水相。
双水相萃取能够实现目标物质从混合物中的分离纯化，常用于生物化学、制药、环境监测等领域。
与传统的单相溶剂萃取相比，双水相萃取具有高选择度、高灵敏度、快速分离和减少环境污染等优点，在实际应用中具有广泛的应用前景。
双水相萃取的核心原理是不同物质在两相之间的分配差异。
混合物溶解在有机溶剂相中后，目标物质会因其在两相中的溶解度不同而分配到两相中。
根据目标物质在两相中的分配系数，可以通过调整两相的物理化学性质，例如溶剂种类、pH值和离子强度等，来控制目标物质的转移和分离。
在双水相萃取中，通常使用的有机溶剂相为水不溶性有机溶剂，例如丁醚、乙醚、正己烷等。
水相通常为含有盐或酸碱调节剂的水溶液。
混合物溶解在有机溶剂相中后，通过搅拌、超声波处理等方法，使混合物中的目标物质与两相中的溶剂发生混溶，然后静置使两相分层。
最后，可以通过分液、离心等方式分离出两相，从而得到纯净的目标物质。
双水相萃取在实际应用中，常常与其他分离和纯化技术相结合，例如薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等，以实现更精确、高效的分离和纯化。
该技术不仅适用于分离化学品、天然产物、有机合成产物等有机化学领域，也可用于生物分子、生物体内代谢产物等在生物化学、制药等领域中的应用。
总之，双水相萃取是一种基于物质在两种不相溶的溶剂相中分配差异来实现目标物质的分离和纯化的物理化学方法。
它具有许多优点，广泛应用于化学、生物化学、制药和环境监测等领域，并与其他分离和纯化技术相结合，促进了科学研究和工业生产的发展。
双水相萃取名词解释
双水相萃取名词解释双水相萃取是一种分离技术，是通过在混合液体中将一种物质分离出来的过程。
该过程常用于将两种不同物质分离开来，如果它们具有相同的电荷和形状，它们就可以在混合液体中被有效分离。
双水相萃取基于一种叫作分配系数的概念。
分配系数是物质之间的电荷和形状的比率，它决定了物质在混合液体中的分布情况。
根据分配系数的不同，被萃取的物质将分布在两个不同的表面上。
在双水相萃取中，混合液体会被分为两个相分离部分，一部分富含物质A，而另一部分富含物质B。
在双水相萃取过程中，混合液体会被放入一容器中，然后以静态或动态的方式搅拌，使物质A和B之间的分配系数得到改变。
当混合液体中的物质A和B改变分布率时，它们就会被从中分离出来。
这种技术可以极大地提高物质分离的速度，从而使分离的效率极高，而且还可以分离出非常精细的物质，如大小不一的纳米粒子等。
双水相萃取技术在药物分离、石油分离、食品加工等领域具有广泛应用，可以帮助工程师们解决大量问题，提高产品质量与生产效率。
此外，双水相萃取还可以用于能源转换，可以将太阳能和风能有效转换为其它形式的能源，以满足人类的能源需求。
综上所述，双水相萃取是一种重要的技术，它可以解决大量混合液体中不同物质的分离问题，在药物分离、石油分离、食品加工等领域有着广泛应用，帮助工程师们极大地提高分离的速度和效率，并可以将能源有效转换。
虽然双水相萃取技术带来了诸多好处，但是它也有一定的局限性。
由于其基本原理是以分配系数为基础的，在进行双水相萃取时，受到混合液体种类的限制，只能用于水基混合液体。
此外，双水相萃取过程中所产生的废水也不能直接排放，必须经过处理才能安全排放。
因此，在进行双水相萃取之前，需要进行充分的技术评估，确保双水相萃取过程安全有效。
双水相萃取技术的发展越来越快，它不仅帮助我们解决了大量的分离问题，而且还能帮助满足人类能源需求。
未来，双水相萃取技术将会得到更深入的研究，希望有一天它能够应用到更加广泛的领域，为促进人类社会发展作出更多的贡献。
第十章双水相萃取
▪ 如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相) 的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相 中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。
▪ 这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质 的分配系数。
▪ 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利 用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓 度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。
▪ PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生 物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG， 下相富含无机盐。
典型的双水相体系
物质类型
物质P的名称
两种非离子型聚合物
聚丙二醇
P为带电荷聚电解质
P Q都为聚电解质 P为聚合物 Q为盐类
聚乙二醇（PEG）
硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 聚乙二醇
双水相系统的应用
双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践上 都有很大的发展。在最近几年中更为突出,在若干生物 工艺过程中得到了应用，其中最重要的领域是蛋白质 的分离和纯化。
▪ (1) 产品的浓缩 ▪ （2）蛋白质的提取和纯化 ▪ （3）生物小分子的分离和纯化 ▪ （4） 中草药有效成分的提取 ▪ （5）生物活性物质的分析检测
11.3.4 温度的影响
温度影响双水相系统的相图， 因而影响蛋白质的分配系数。 但一般来说，当双水相系统离 双节线足够远时，温度的影响 很小，1-2度的温度改变不影响 目标产物的萃取分离。
大规模双水相萃取操作一般在
室温下进行，不需冷却。这是 基于以下原因：(1)成相聚合物 PEG对蛋白质有稳定作用，常 温下蛋白质一般不会发生失活 或变性；(2)常温下溶液粘度较 低，容易相分离；(3)常温操作 节省冷却费用。
• 氢键 • 电荷力 • 疏水作用 • 范德华力 • 构象效应
第五节_双水相萃取
二、双水相萃取的原理
• 双水相萃取的原理 • 是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物 质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用 和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的 存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不 同，即分配系数不同。
三、影响分配系数因素
１、聚合物：不同聚合物的水相系统显示出不同 的疏水性，同一聚合物的疏水性随分子量的增加 而增加。 ２、pH：主要针对蛋白质及酶的稳定性。 ３、无机盐：离子环境影响溶质（蛋白质）在两 相系统中的分配。 ４、温度：分配系数对温度的变化不敏感，所以 室温操作即可。
双水相的形成
将两种不同的水溶到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这
就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分 相的现象叫聚合物的不相容性。
形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子 的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而 具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
常用的双水相体系
高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简 称Dextran) 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机 盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran)
第五节 双水相萃取
(Aqueous two-phase extraction, ATPE)
定义：利用物质在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。
一、双水相的形成 二、双水相萃取的原理 三、影响分配系数因素 四、双水相萃取的优点 五、 双水相萃取的应用
一、双水相的形成
1896年Beijerinck发现， 当明胶与琼脂或明胶与可 溶性淀粉溶液相混时，得 到一个混浊不透明的溶液， 随之分为两相，上相富含 明胶，下相富含琼脂（或 淀粉）。
双水相的萃取原理及应用
双水相的萃取原理及应用双水相萃取是一种常用的分离纯化技术，其原理是将两种互不相溶的溶剂（一般是水和有机溶剂）在适当的条件下混合形成两个相，通过溶质在两相间的分配系数差异，使溶质转移到另一相中来实现分离纯化。
双水相萃取技术在生物医药、食品工业、环境监测等领域有广泛的应用。
双水相萃取的原理可以通过亲水基团和疏水基团之间的相互作用来解释。
当有机溶剂向水中注入时，溶剂分子中的疏水基团与水中的活泼基团（如羟基和胺基）发生作用，形成一层水合包裹层。
这种水合包裹层使有机溶剂和水发生互溶性差异，从而使两种溶剂形成不相容的两个相。
双水相萃取的应用可以归纳为以下几个方面：1. 生物活性物质分离纯化：双水相萃取广泛应用于生物活性物质分离纯化领域，例如从植物提取出天然产物（如植物提取物中的生物碱、黄酮、甾醇等）；从微生物培养液中提取酶、蛋白质等生物活性物质；海洋生物样品的提取等。
双水相萃取可以有效地分离目标物质并去除一些干扰性物质，提高目标物质的纯度和产率。
2. 蛋白质的分离纯化：双水相萃取可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质在不同的条件下会有不同的溶解度，通过调节溶剂的性质和条件，可以使目标蛋白质在双水相中的分配系数大于1，从而实现蛋白质的富集和分离纯化。
3. DNA/RNA的提取：双水相萃取也可用于DNA/RNA的提取。
DNA/RNA在某些条件下与有机溶剂形成复合物，可以通过双水相萃取的方法将DNA/RNA 从混合物中分离出来。
这是分子生物学研究中常用的一种DNA/RNA提取方法。
4. 药物研发：双水相萃取在药物研发中有着重要的应用。
药物研发中常常需要提取、分离纯化目标化合物，双水相萃取可以通过调节溶剂体系的性质和条件，实现对复杂混合物中目标化合物的分离纯化，从而提高化合物的纯度和产率，为药物研发提供了有效的手段。
除了上述应用外，双水相萃取还可以用于环境监测、食品工业等领域。
例如，在环境监测中，可以利用双水相萃取将有机污染物和水样分离，进而进行有机污染物的检测与分析。
第五章 双水相萃取
• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
5.Βιβλιοθήκη 6.第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
双水相萃取的名词解释
双水相萃取的名词解释双水相萃取是萃取的一种方法。
两种水溶性不同的聚合物，或一种聚合物和无机盐的混合溶液，在一定的浓度下，其体系会自然分成互不相溶的两相。
当被分离物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷间作用和各种作用力等的影响，被分离物质在两相间的分配系数不同，导致其在上下相的浓度不同，即可达到分离的目的。
早在1896年人们就已观察到，明胶与琼脂，或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，会得到一种不透明的混合溶液。
静置后可分为两相，上相中含有大部分的明胶，下相中含有大部分琼脂（或淀粉），这种现象称为聚合物的不相容性，从而产生了双水相。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比。
各种物质的K值不同，例如各种类型的细胞粒子、噬菌体等分配系数都大于100或小于0.01，酶、蛋白质等生物大分子的分配系数在0.1~10之间，而小分子盐的分配系数在1.0左右。
因而，双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。
双水相的优势ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：(1)含水量高(70％--90％)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min；(4)界面张力小(10-7～10-4mN／m)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；(5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；(6)大量杂质可与固体物质一同除去；(7)易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；(8)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
双水相萃取原理
双水相萃取原理
双水相萃取是一种将有机物从水溶液中分离出来的方法。
它基于水和有机溶剂不相溶的性质，通过两相之间的分配系数差异来实现目标物质的选择性提取。
双水相萃取的原理是利用两种互不相溶的溶剂（一般是水和有机溶剂），在某一条件下将目标物质在两相之间分配。
通常情况下，有机物更易溶于有机相，而无机物更易溶于水相。
具体的操作步骤如下：首先将水溶液和有机溶剂混合，形成两相体系。
然后经过搅拌或震荡，让目标物质在两相之间达到平衡分配。
接下来，待两相分离后将有机相和水相分开。
最后，可以通过蒸发或其他方法将目标物质从有机相中提取出来。
双水相萃取的选择性是基于目标物质在两相之间的分配系数差异。
分配系数是指物质在两相之间分配的比例，由物质的溶解度和两相的互溶性决定。
通常情况下，选择合适的有机溶剂和水相条件可以使目标物质在有机相中富集，而其他杂质则大部分留在水相中。
双水相萃取的优点是操作简单、成本低廉，适用于大量样品的初步分离和富集。
但是也存在一些局限性，例如只适用于水溶液中的有机物质，对目标物质的选择性有一定要求。
总之，双水相萃取是一种利用两相体系中的分配差异来实现目标物质提取的方法。
通过选择合适的有机相和水相条件，可以实现对目标物质的选择性富集，从而达到分离和纯化的目的。
双水相萃取
操作步骤
一、重点 双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤： 1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。 3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。 4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活 性测定中产生的系统误差。 6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。 二、特点： 1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。 2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/ 葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与 无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃 取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成 双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质， Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。 20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化 开辟了新的途径。
第五章 双水相萃取
第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）
二、双水相系统的相图
三、双水相萃取的分配平衡公式
c1 1 A Z（U 1 U 2） exp c2 KT
四、影响双水相萃取分配平衡的因素
• 高聚物的种类与浓度 • 高聚物的分子量
一般规律：对于给定的双水相萃取系统，如果其中一种高 聚物被较低分子量同种高聚物所代替，则被萃取的生物大 分子物质将有利于在低分子量高聚物的一相富集。
• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
双水相萃取专业知识
两相物性旳差别，使双水相萃取具有本身旳特征。
特征：
操作条件温和 表面张力大大低于有机溶剂相与水相间旳表面张力； 两相分散旳耗能低，分散程度高，传质面积大，传质速率快； 在温和旳萃取条件下，到达较高旳萃取效率。
安全性能高 药物生产，双水相萃取质量和安全性好； 高聚物一般为不易挥发物质，操作环境对人体无害。
这种易于放大旳优点对于新药研制 中生产工艺旳开发极为有利
双水相萃取技术旳进展
用变性淀粉PPT替代昂贵旳Dextran。PPT-PEG体系 已被用于从发酵液中分离过氧化氢、β-半乳糖甘 酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定，和PEGDextran体系相图非常相同，并具有下列优点：
伴随生物技术旳发展,必将增进双水 相萃取体系旳完善,从而更显示出双水 相体系萃取分离技术在生物物质分离 中旳独特优点.
在双水相系统中旳被分离物传质速度快，因而到达 分配旳时间短，但因两相密度相差小，分配困难， 是其主要矛盾。
利用离心沉淀可加紧相分离速度
体系旳选择和优化
1）、体系选择旳原则： 根据目旳pro和共存杂质旳HFS\M\pI\Z等旳差别, 综合利用静电、 疏水和添加合适种类和浓度旳盐，可选择性萃取目旳产物。
双水相旳类型： 离子型高聚物－非离子型高聚物 PEG－DEXTRAN 高聚物－相对低分子量化合物 PEG－硫酸铵
当两种高聚物水溶液混合物混合后旳总构成点 落在两相区（如：点M）可形成互不相溶旳两 相T和B。两相旳构成和密度均不同。一般，T 相为上层，高聚物PEG含量较高；B相为下层， 高聚物KPI含量较高。
双水萃相取旳理论基础
表面电荷
当盐旳正、负离子对上下相有不同旳亲和力，即 正负离子旳分配系数不同步，就会产生电位。
双水相萃取技术详解
4.3 在医药行业的应用
双水相体系不仅可以用于分离医药行业需要的细胞，还 可以用来高效的提取抗生素。抗生素不仅能杀灭细菌，而且 对支原体、衣原体等致病微生物也具有良好的抑制及杀灭效 果。所以双水相萃取技术在医药行业得到广泛认可。 如： ①利用免疫亲和性PEG/Dextran 双水相体系从脐带血中分离 造血干细胞/源细胞。 ②亲水性离子液体 1-丁基-3- 甲基咪唑四氟硼 BF₄和 NaH₂PO₄形成的双水相体系能够快速从青霉素水溶液中萃取 青霉素G。 ③用亲水性离子液体四氟硼酸 1-丁基-3- 甲基咪唑四氟硼 BF4 和 NaH2PO₄组成的双水相体系萃取分离四环素。
2.1.4 相图
图1是典型的高聚物-高聚 物-水双水相体系的直角坐标 相图。两种聚合物A、B以适 当比例溶于水就会分别形成 有不同组成密度的两相。轻 相组成用T点表示，重相组成 用B点表示。曲线ＴＣＢ称为 结线，直线ＴＭＢ称为系线 。结线上方是两相区，下方 为单相区。
●
其中上下相组成分别为T和B， T和B量的遵循杠杆定律: 即T和B相质量之比等于系线 上MB与MT的线段长度之比。
⑤为降低成本和保证安全操作，应将成本高的和易燃易爆的液
体作为分散相。
产生分散相的动 力 重力差
微分接触式 喷啉塔、填料塔
逐级接触式 筛板塔、流动混合 器
机械搅拌
转盘萃取塔、搅拌 萃取塔、振动筛板 塔 脉冲填料塔、脉冲 筛板塔 连续式离心萃取器
混合澄清器
脉冲
离心力作用
脉冲混合澄清器
逐级式离心萃取器
3.5.2 脉动填料塔
3.3进行两水相生物转化反应需满足以下条件
● 催化剂应单侧分配； ● 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配 在另
一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则
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聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时， 会出现两个不相混溶的水相
②聚合物∕无机盐双水相
某些聚合物溶液和一些无机盐溶液 相混时，在一定浓度下，由于盐析作 用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸 盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外， 能形成双水相体系的物质还有高分子 电解质、低分子量化合物。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 葡聚糖
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
缺点：
• 成相聚合物的成本较高， 且高聚物回收困难。 • 水溶性高聚物大多数粘度 较大，不易定量控制。 • 易乳化，相分离时间较长。 • 影响因素复杂。
3、双水相萃取原理
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的 原理相似, 都是依据物质在两相间的选择 性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进 入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、 疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之 间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的 浓度不同, 从而达到分离的目的。
双水相体系的双结线模型
系线上的各点上 下相的组成相同，而 体积不同，上下相的 体积比近似服从杠杆 原理，即： Vt/Vb=Ab/At 其中， Vt/Vb分 别为上相和下相体积， Ab/At分别为A点与B 点和A点与T点之间的 距离。
双水相体系的双结线模型
系线长度通过下式 计算：
△代表上下相的 浓度差。一般情 况下，体系对被 分配物质的处理 能力与系线长度 成正比。
① 聚合物∕聚合物双水相
当2种聚合物混合时，由于2种聚合物 间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无 法相互渗透，不能形成均一相，故达到平 衡后形成两相，这2种聚合物分别位于互 不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物 双水相体系。
聚合物双水相形成机理
两种聚合物 相互混合 体系熵的增加 两个因素 混合 分离（聚合物的不相容性） 分子间作用力
但一般来说，当双水相系统离双节线足够 远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不 影响目标产物的萃取分离。 大规模双水相萃取操作一般在室温下进行， 不需冷却。这是基于以下原因： (l)常温下，溶液的粘度较低，容易分相 (2)成相聚合物PEG对某些具有生物活性溶 质如蛋白质有稳定的作用，常温下蛋白质一般 不会发生失活、变性。 (3)常温操作节省冷却费用。
以PEG4000∕硫酸铵双水相体系为例
①建立PEG4000的吸光度-质量分数标准 曲线
②建立硫酸铵的电导率-质量分数标准 曲线
③建立PEG4000∕硫酸铵双水相相图
约取5mL20%的PEG4000溶液溶于50mL的 离心管里面,用100μL移液器逐滴加入40% 的硫酸铵溶液,振荡混匀直至出现浑浊，将 混合液放在离心机上离心5min,溶液分层后 分别取其上、下相各1克稀释100倍,并测其 电导率记录数据。再取溶液上下相的溶液 各1克溶于100mL容量瓶中，测定其吸光度 并记录数据。
分相
富含不同聚合物的两相
形成双水相的双聚合物体系很多， 如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/ 葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇 (polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲 基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。 双水相萃取中常采用的双聚合物系统 为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG， 下相富含Dx。
2）聚合物及其相对分子质量
不同聚合物的水相系统，疏水性不同； 同一聚合物，疏水性随分子量增加而增加， 其大小的选择取决于萃取过程的目的和方 法，在PEG/Dex体系中，PEG分子量的减少， 会使萃取液在两相中的分配系数增大，当 PEG的分子量增加时，在质量浓度不变的 情况下，亲水性蛋白质不再向富含PEG相 中聚集而转向另一相。
(2) 萃取率
当某一物质A的水溶液, 用有机溶剂萃取 时, 则萃取率E应该等于: E= 有机相中被萃取物的量 ×100% 两相中被萃取物的量 萃取率反应了物质被萃取的完全程度。 双水相萃取是一种可以利用较为简单的 设备，并在温和条件下进行简单操作就可获 得较高收率和纯度的新型分离技术。
双水相体系中相关的计算公式为：
6）无机盐的浓度
盐的正、负离子在两相间分配系数不 同，两相间形成电位差，从而影响带电 生物大分子的分配。无机盐浓度的不同 能改变两相间的电位差。
利用双水相萃取技术分离纯化时， 其选择双水相体系的一般原则是: (l)目标产物在两相中有较大的分配系数 (2)能保持具有生物活性溶质的活性 (3)体系易于分相，可利用静止或者离心 沉降法进行分相 (4)降低操作成本，采用廉价的双水相体 系来萃取分离
两相区
双节线
临界点
二、双水相萃取工艺流程操作
工艺流程主要由三部分组成：
• 目标产物的萃取 • 聚合物（PEG)的循环 • 无机盐的循环
双水相萃取工艺流程图
萃取液
相似相溶原理
上相
PEG
ATPE
无机盐
相体系回收示意图
PEG的循环
在大规模双水相萃取过程中，成相材料 的回收和循环使用，不仅可以减少废水处 理的费用，还可以节约化学试剂，降低成 本。PEG回收有2种方法：一种即前面所述 的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG， 一种是将PEG通过离子交换树脂，洗脱剂先 洗出PEG，再洗出蛋白质。现在常用的方法 是将第1步萃取的PEG相或除去部分蛋白质 的PEG相循环利用。
其分配规律服从Nernst分配定律，即 K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分别为上相和下相的浓度， K为分配系数。各种物质的分配系数K是不一样 的，因而双水相体系对生物物质的分配具有很 大的选择性。 系统固定时,分配系数K为一常数, 与溶质 的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后， 在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关 系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或 更小的分配系数。
尽管刚开始应用时，大多数双水相萃 取是间歇式的，但此技术更适合于错流萃 取的连续生产，这样可有效利用空间和时 间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、 膜分离等相结合使用时。1988 年， Hustedt 等人证明在工业生产规模上可将 双水相体系用于连续错流萃取延胡索酸酶 和青霉素配基转移酶。
三、影响双水相萃取的因素
双水相萃取技术
( aqueous two-phase extraction )
主要内容：
一、双水相萃取的基本理论 二、双水相萃取工艺流程操作
三、影响双水相的因素
四、双水相萃取的应现象最早是1896年由Bei jerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的， 这种现象被称为聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。 • 20 世纪 60 年代瑞典 Lund 大学的 Albertsson P A及其同事们最先提出双水相萃取技术并做 了大量的工作。 • 70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等 人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中 提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取 效果。
双水相体系的双结线模型
系线越长，界 面张力就越大，两 相间的性质差别就 越大，被分配物质 在相间分配系数K亦 越大;反之就越小。 当系线长度趋向于 零即接近于临界点 (criticalpoini， 简称Cp)时，两相差 别消失，界面张力 为零，体系成为均 一的一相。
双水相体系的双结线模型
a 系线 b 两相区 系线 双节线 均相区 均相区
无机盐的循环
一种方法是将无机盐相冷却，如将含 磷酸钠的盐相冷却到6℃，使盐结晶析出， 然后用离心机分离收集；另一种是用电渗 析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的 盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他 两相体系如水和有机溶剂体系所通用的设 备，有商业化的混合器和沉淀器系统以及 离心分离机已成功应用于双水相萃取。
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
2、双水相体系的特点
优点：
• 操作条件温和，在常温常压 下进行。 • 两相的界面张力小，一般在 10-4N/cm 量级，两相易分散。 • 两相的相比随操作条件而变 化。
• 易于连续操作，处理量大，适合工 业应用。 • 两相的溶剂都是水，上相和下相的 含水量高达70%～ 90%，不存在有机 溶剂残留问题。
温度对双水相系统的影响
5）PH值的影响
体系pH值会影响溶液分子中可离解基 团的离解度，从而改变分子表面的电荷数 来影响分配。同时PH值还会影响缓冲离子 如HPO42-、PO43-等的分配，以改变相间电 位来达到改变分配系数的目的。另外在研 究分配系数与pH值的关系时，若加入不同 种类的中性盐，由于电位差的不同，其相 应关系也不同。
Fig.1 PEG200(400)-(NH4)2SO4 相图 60 50 40
PEG_400 PEG200
PEG （% w/w)
30 20 10 0
8
12
16
20
24
28
32