双水相萃取全解

(2) 萃取率
当某一物质A的水溶液, 用有机溶剂萃取 时, 则萃取率E应该等于: E= 有机相中被萃取物的量 ×100% 两相中被萃取物的量 萃取率反应了物质被萃取的完全程度。 双水相萃取是一种可以利用较为简单的 设备，并在温和条件下进行简单操作就可获 得较高收率和纯度的新型分离技术。
双水相体系中相关的计算公式为：
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
6）无机盐的浓度
盐的正、负离子在两相间分配系数不 同，两相间形成电位差，从而影响带电 生物大分子的分配。无机盐浓度的不同 能改变两相间的电位差。
利用双水相萃取技术分离纯化时， 其选择双水相体系的一般原则是: (l)目标产物在两相中有较大的分配系数 (2)能保持具有生物活性溶质的活性 (3)体系易于分相，可利用静止或者离心 沉降法进行分相 (4)降低操作成本，采用廉价的双水相体 系来萃取分离
②聚合物∕无机盐双水相
某些聚合物溶液和一些无机盐溶液 相混时，在一定浓度下，由于盐析作 用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸 盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外， 能形成双水相体系的物质还有高分子 电解质、低分子量化合物。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 葡聚糖
一、双水相萃取的基本理论
1、双水相体系的组成 2、双水相萃取的特点 3、双水相萃取原理
1、双水相体系的组成
双水相体系的主要成因——聚合物的 不相溶性
双水相现象是当两种聚合物或一种聚 合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合 物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍 作用，无法相互渗透，当聚合物或无机盐 浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两 相，因为使用的溶剂是水，所以称为双水 相。
综合利用以上因素，可通过实验确定最佳双 水相萃取系统。以PEG/硫酸铵双水相体系萃取 一种蛋白质为例： （1）固定硫酸铵为某一浓度，用梯度浓度的 聚乙二椁与其形成一系列双水相体系，萃取分 离蛋白质，分别测量上、下相蛋白质的含量， 确定PEG的最佳浓度。 （2）选取（1）中的最佳PEG浓度，在此浓度 下与梯度浓度的硫酸铵形成双水相体系，进行 蛋白质的萃取分离，测定上、下相中蛋白质的 含量，确定出最佳的硫酸铵浓度。
无机盐的循环
一种方法是将无机盐相冷却，如将含 磷酸钠的盐相冷却到6℃，使盐结晶析出， 然后用离心机分离收集；另一种是用电渗 析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的 盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他 两相体系如水和有机溶剂体系所通用的设 备，有商业化的混合器和沉淀器系统以及 离心分离机已成功应用于双水相萃取。
4）温度的影响
温度的变化影响相物理性质的变化，例 如粘度和密度等，从而影响萃取液的分配。 但总的来说，温度对分配系数的影响是通过 对相图的影响来间接达到的。在临界点附近， 温度对相图的影响最显著，对分配系数的影 响最强。当远离临界点时，温度对相图的影 响较小，分配系数对温度的变化也不敏感。 这是由于远离临界点时，成相聚合物的浓度 增大，对萃取液的稳定作用增强。
以PEG4000∕硫酸铵双水相体系为例
①建立PEG4000的吸光度-质量分数标准 曲线
②建立硫酸铵的电导率-质量分数标准 曲线
③建立PEG4000∕硫酸铵双水相相图
约取5mL20%的PEG4000溶液溶于50mL的 离心管里面,用100μL移液器逐滴加入40% 的硫酸铵溶液,振荡混匀直至出现浑浊，将 混合液放在离心机上离心5min,溶液分层后 分别取其上、下相各1克稀释100倍,并测其 电导率记录数据。再取溶液上下相的溶液 各1克溶于100mL容量瓶中，测定其吸光度 并记录数据。
双水相体系的双结线模型
系线上的各点上 下相的组成相同，而 体积不同，上下相的 体积比近似服从杠杆 原理，即： Vt/Vb=Ab/At 其中， Vt/Vb分 别为上相和下相体积， Ab/At分别为A点与B 点和A点与T点之间的 距离。
双水相体系的双结线模型
系线长度通过下式 计算：
△代表上下相的 浓度差。一般情 况下，体系对被 分配物质的处理 能力与系线长度 成正比。
双水相萃取技术
( aqueous two-phase extraction )
主要内容：
一、双水相萃取的基本理论 二、双水相萃取工艺流程操作
三、影响双水相的因素
四、双水相萃取的应用 五、双水相萃取技术的发展
前 言
• 双水相萃取现象最早是1896年由Bei jerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的， 这种现象被称为聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。 • 20 世纪 60 年代瑞典 Lund 大学的 Albertsson P A及其同事们最先提出双水相萃取技术并做 了大量的工作。 • 70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等 人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中 提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取 效果。
其分配规律服从Nernst分配定律，即 K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分别为上相和下相的浓度， K为分配系数。各种物质的分配系数K是不一样 的，因而双水相体系对生物物质的分配具有很 大的选择性。 系统固定时,分配系数K为一常数, 与溶质 的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后， 在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关 系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或 更小的分配系数。
双水相体系的双结线模型
系线越长，界 面张力就越大，两 相间的性质差别就 越大，被分配物质 在相间分配系数K亦 越大;反之就越小。 当系线长度趋向于 零即接近于临界点 (criticalpoini， 简称Cp)时，两相差 别消失，界面张力 为零，体系成为均 一的一相。
双水相体系的双结线模型
a 系线 b 两相区 系线 双节线 均相区 均相区
Fig.1 PEG200(400)-(NH4)2SO4 相图 60 50 40
PEG_400 PEG200
PEG （% w/w)
30 20 10 0
8
12
16
20
24
28
32
36
(NH4)2SO4(%w/W)
3）聚合物的浓度
在双水相系统中，界面张力很低并且随双 曲线长度呈指数规律的增大。当系统组成处于 临界点时，系线长度为零，上下相组成相同， 萃取液均匀地分配在两相中，分配系数K=1。当 成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓 度增加时，系统远离临界点，系线长度增大， 两相性质的差别也增大，同时萃取液在两相中 界面张力的差别增大，使其趋于向一侧分配， 即K值或增大超过1，或减小低于1。
聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
ຫໍສະໝຸດ Baidu
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时， 会出现两个不相混溶的水相
分相
富含不同聚合物的两相
形成双水相的双聚合物体系很多， 如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/ 葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇 (polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲 基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。 双水相萃取中常采用的双聚合物系统 为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG， 下相富含Dx。
缺点：
• 成相聚合物的成本较高， 且高聚物回收困难。 • 水溶性高聚物大多数粘度 较大，不易定量控制。 • 易乳化，相分离时间较长。 • 影响因素复杂。
3、双水相萃取原理
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的 原理相似, 都是依据物质在两相间的选择 性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进 入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、 疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之 间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的 浓度不同, 从而达到分离的目的。
两相区
双节线
临界点
二、双水相萃取工艺流程操作
工艺流程主要由三部分组成：
• 目标产物的萃取 • 聚合物（PEG)的循环 • 无机盐的循环
双水相萃取工艺流程图
萃取液
相似相溶原理
上相
PEG
ATPE
无机盐
相体系回收示意图
PEG的循环
在大规模双水相萃取过程中，成相材料 的回收和循环使用，不仅可以减少废水处 理的费用，还可以节约化学试剂，降低成 本。PEG回收有2种方法：一种即前面所述 的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG， 一种是将PEG通过离子交换树脂，洗脱剂先 洗出PEG，再洗出蛋白质。现在常用的方法 是将第1步萃取的PEG相或除去部分蛋白质 的PEG相循环利用。
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
2、双水相体系的特点
优点：
• 操作条件温和，在常温常压 下进行。 • 两相的界面张力小，一般在 10-4N/cm 量级，两相易分散。 • 两相的相比随操作条件而变 化。
• 易于连续操作，处理量大，适合工 业应用。 • 两相的溶剂都是水，上相和下相的 含水量高达70%～ 90%，不存在有机 溶剂残留问题。
接着在混合液中加入一定量的去离子 水至浑浊变澄清，再次逐滴加入硫酸铵 溶液至出现浑浊且半分钟内浑浊不变化， 重复上述步骤。根据测量数据作出 PEG4000∕硫酸铵溶液的双水相相图。
图中的曲线为双结线 (Binodal)，双结线 以下的区域为均相区， 以上的区域为两相区， 也称为工作区。连接 双结线上两点的直线 称为系线(Tie一line， 简称TL)，表示了双 水相体系达到相平衡 时上、下相组成和总 组成的关系。
① 聚合物∕聚合物双水相
当2种聚合物混合时，由于2种聚合物 间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无 法相互渗透，不能形成均一相，故达到平 衡后形成两相，这2种聚合物分别位于互 不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物 双水相体系。
聚合物双水相形成机理
两种聚合物 相互混合 体系熵的增加 两个因素 混合 分离（聚合物的不相容性） 分子间作用力
温度对双水相系统的影响
5）PH值的影响
体系pH值会影响溶液分子中可离解基 团的离解度，从而改变分子表面的电荷数 来影响分配。同时PH值还会影响缓冲离子 如HPO42-、PO43-等的分配，以改变相间电 位来达到改变分配系数的目的。另外在研 究分配系数与pH值的关系时，若加入不同 种类的中性盐，由于电位差的不同，其相 应关系也不同。
尽管刚开始应用时，大多数双水相萃 取是间歇式的，但此技术更适合于错流萃 取的连续生产，这样可有效利用空间和时 间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、 膜分离等相结合使用时。1988 年， Hustedt 等人证明在工业生产规模上可将 双水相体系用于连续错流萃取延胡索酸酶 和青霉素配基转移酶。
三、影响双水相萃取的因素
但一般来说，当双水相系统离双节线足够 远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不 影响目标产物的萃取分离。 大规模双水相萃取操作一般在室温下进行， 不需冷却。这是基于以下原因： (l)常温下，溶液的粘度较低，容易分相 (2)成相聚合物PEG对某些具有生物活性溶 质如蛋白质有稳定的作用，常温下蛋白质一般 不会发生失活、变性。 (3)常温操作节省冷却费用。
R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK， Y=（1+1／RK）-1 ×100％ 式中：R－相比；Vb－下相体积，mL； Vt－上相体积，mL； K－分配系数； Cb－下相溶质的质量浓度，g／mL； Ct －上相溶质的质量浓度，g／mL； G－上、下相溶质的质量比； Y－萃取率，％。
(3) 双水相相图制作
2）聚合物及其相对分子质量
不同聚合物的水相系统，疏水性不同； 同一聚合物，疏水性随分子量增加而增加， 其大小的选择取决于萃取过程的目的和方 法，在PEG/Dex体系中，PEG分子量的减少， 会使萃取液在两相中的分配系数增大，当 PEG的分子量增加时，在质量浓度不变的 情况下，亲水性蛋白质不再向富含PEG相 中聚集而转向另一相。