酶联免疫吸附试验双抗体夹心法
双抗体夹心实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握双抗体夹心法的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用ELISA技术检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。
3. 分析实验结果，验证实验方法的有效性和准确性。
二、实验原理双抗体夹心法是一种常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用于检测抗原。
其基本原理是将抗原与抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗体，通过显色反应判断抗原含量。
具体步骤如下：1. 将已知抗体包被于固相载体上，形成固相抗体。
2. 加入待测标本，若标本中含有目标抗原，则与固相抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 洗涤去除未结合的标本。
4. 加入酶标记的抗体，该抗体能与抗原-抗体复合物中的抗原结合。
5. 再次洗涤去除未结合的酶标记抗体。
6. 加入底物，底物在酶的催化下发生颜色变化，颜色深浅与抗原含量成正比。
三、实验材料1. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）标准品2. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体3. 酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体）4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒5. 微孔板6. 仪器：酶标仪、离心机、移液器等四、实验步骤1. 包被抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体稀释后，加入微孔板中，每孔100μl，37℃孵育过夜。
2. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
3. 封闭：加入封闭液，每孔200μl，37℃孵育1小时。
4. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
5. 加样：将待测标本、阳性对照、阴性对照和空白对照分别加入对应的孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。
6. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
7. 加酶标记二抗：将酶标记的二抗稀释后，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。
8. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。
9. 加底物：将底物A液和B液按比例混合，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育15分钟。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Dual-Antibody Sandwich Assay）是一种常用于蛋白质检测的实验方法。
该方法通过同时使用两种特异性抗体，实现对目标蛋白的夹心检测，具有较高的灵敏度和特异性。
本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。
一、原理双抗体夹心法原理基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理发展而来。
其主要步骤包括涂覆、夹心、检测和信号检测等。
首先，实验者将一种特异性抗体沉积于固定载体（如微孔板）表面，形成抗原夹心层。
然后，待测物中的目标蛋白与夹心层中的特异性抗体结合。
接下来，实验者使用另一种与目标蛋白不同抗原冠名的特异性抗体，即“第二抗体”，来与目标蛋白结合。
第二抗体通常与酶标记有关，如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，通过添加特定底物，比如TMB（3,3', 5,5'-四甲基联苯胺）或BMP（2,2'-联氨苯胺），来观察信号的产生。
由于目标蛋白与第一、第二抗体同时结合，因此形成了一个夹心型结构。
这种双抗体夹心的结构能够在分析前富集目标蛋白，并增强信号的产生。
通过比较待测样品与已知浓度的标准曲线，可以确定待测物样品中目标蛋白的含量。
二、应用双抗体夹心法在生物医学及生命科学研究中得到了广泛的应用。
其主要应用领域包括药物研发、临床诊断和生物工程等。
在药物研发中，双抗体夹心法可用于药物候选分子的筛选和鉴定。
通过测定目标蛋白的含量，可以评估药物分子对目标蛋白的亲和力和选择性。
在临床诊断中，双抗体夹心法可用于检测体液中的生物标志物。
生物标志物是与疾病状态相关联的分子，如肿瘤标志物。
双抗体夹心法具有高灵敏度和特异性，可以准确、快速地检测这些生物标志物，为临床诊断提供重要依据。
另外，双抗体夹心法在生物工程领域也得到了广泛应用。
它可用于检测和定量表达蛋白。
通过测定特定蛋白的含量，可以评估蛋白表达系统的效率和纯度。
总结起来，双抗体夹心法是一种灵敏、特异、快速的蛋白质检测方法。
免疫学实验ELISA双抗夹心法课件
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分 化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种 固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游 离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物 （间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显 色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
elisa双抗体夹心法实验报告
elisa双抗体夹心法实验报告实验报告：ELISA双抗体夹心法实验一、实验目的本实验旨在通过ELISA双抗体夹心法，检测待测样品中目标蛋白的含量，为相关研究提供依据。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种灵敏的免疫学检测方法，通过将特异性抗体与酶标记结合，实现对目标蛋白的定量检测。
双抗体夹心法是一种常用的ELISA 技术，其原理是将两种特异性抗体分别固定在酶标板的不同位置上，形成两个“抗体夹心”，实现对目标蛋白的双重捕获，从而提高检测的灵敏度和特异性。
三、实验步骤1.酶标板包被：将第一种特异性抗体（capture antibody）包被在酶标板孔中，以固定化抗体形式捕获目标蛋白。
2.封闭：加入封闭液（通常为正常血清或BSA），填充孔内未结合的位点，以减少非特异性吸附。
3.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
4.样本加入：将待测样本加入酶标板孔中，与固定化的抗体发生特异性结合。
5.洗涤：再次洗涤酶标板，以去除未结合的物质。
6.酶标二抗加入：将第二种特异性抗体（detection antibody）与酶标记结合，形成酶标二抗。
将酶标二抗加入酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，形成“抗体夹心”。
7.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
8.显色反应：加入底物溶液，发生显色反应。
若目标蛋白存在，则呈现颜色变化。
9.终止反应：加入终止液，停止显色反应。
10.吸光度测定：用酶标仪测定各孔的吸光度值（通常在450nm处测量），根据吸光度值判断目标蛋白的含量。
四、实验结果根据实验数据，绘制标准曲线图和散点图，分析待测样品中目标蛋白的含量。
通常，标准曲线图横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光度值。
通过将待测样品的吸光度值与标准品进行比较，计算出待测样品中目标蛋白的浓度。
五、实验总结本实验通过ELISA双抗体夹心法成功检测了待测样品中目标蛋白的含量。
实验过程中需注意保持操作环境的清洁和干燥，避免影响实验结果。
酶联免疫吸附试验ELISA双抗原夹心法
附件9 酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗原夹心法
检测血清总抗体
试验材料：
（1）纯化的重组汉坦病毒核蛋白抗原预包被酶标板：
（2）辣根过氧化物酶标记的纯化的重组汉坦病毒核蛋白抗原；
（3）缓冲液：
包被液：pH9. 6碳酸缓冲液；
稀释液：pH7.4 PBS（含5%脱脂奶）
洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）；
（4）显色液：A/B液
（5）终止液：4N H
2SO
4
（6）酶标板、酶标仪。
检测步骤：
（1）将待检血清加入抗原孔，25μl/孔，同时用稀释液按工作浓度稀释酶标抗原，加入样品孔，25μl/孔，需设阴、阳性对照各3孔，37℃水浴1小时；
（2）用洗涤液洗涤6次，甩干；
（3）加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；
（4）加终止液于每反应孔，一滴/孔。
结果判断：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD均值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为出血热抗体阳性，反之阴性。
（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
意义：阳性结果，表明曾受到汉坦病毒感染。
1。
elisa双抗体夹心法原理
elisa双抗体夹心法原理Elisa双抗体夹心法原理引言：Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子。
其中，双抗体夹心法是Elisa的一种常见应用，它通过特定抗体的结合来检测目标分子的存在。
本文将详细介绍Elisa双抗体夹心法的原理和应用。
一、Elisa双抗体夹心法的原理Elisa双抗体夹心法是一种间接的免疫测定方法，它利用两种不同的抗体来夹持目标分子，从而实现对目标分子的检测和定量分析。
1. 抗原涂覆：首先，在试验板上涂覆含有目标分子的抗原。
这个抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。
涂覆后，将试验板放置在适当的条件下，使抗原与试验板表面结合。
2. 阻断：为了避免非特异性结合，需要在试验板上进行阻断步骤。
通常使用一种无关的蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断未被抗原结合的表面。
3. 第一次抗体结合：将含有特异性抗体的溶液加入试验板中，使其与目标分子结合。
这种特异性抗体通常是由动物免疫产生的，可以识别并结合目标分子。
4. 第一次洗涤：为了去除未结合的第一次抗体，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。
5. 第二次抗体结合：将与酶结合的第二次抗体加入试验板中，使其与第一次抗体结合。
这种第二次抗体通常是与酶（如辣根过氧化物酶）结合的抗体，可以通过酶的催化作用来放大信号。
6. 第二次洗涤：为了去除未结合的第二次抗体，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。
7. 底物添加：将含有底物的溶液加入试验板中，底物与酶的催化作用产生可测量的信号。
常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等。
8. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物的反应，并产生一个可测量的信号。
反应停止剂通常是酸性溶液，可以改变底物的颜色。
9. 信号检测：使用光谱仪或酶标仪等设备，测量底物反应产生的信号强度。
信号的强度与目标分子的浓度成正比，可以通过标准曲线来定量分析目标分子的浓度。
双抗体夹心elisa方法的原理
双抗体夹心elisa方法的原理
宝子，今天咱来唠唠双抗体夹心ELISA方法的原理哈。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定，这双抗体夹心ELISA可有意思啦。
它就像是给抗原这个小坏蛋设了个包围圈。
有两种抗体参与哦。
一种是捕获抗体，就像一个小陷阱，先被固定在检测板上，就等着抗原上钩呢。
这个捕获抗体的形状和抗原的某个部分特别匹配，就像一把钥匙配一把锁一样。
然后呢，咱们要检测的抗原就大摇大摆地来了，它一头就扎进了捕获抗体这个小陷阱里，紧紧地结合在一起啦。
这时候，另一种抗体，也就是检测抗体就登场啦。
检测抗体也是专门针对抗原的，它从另一个方向和抗原结合，就像给抗原来了个前后夹击。
这个检测抗体还带着特殊的标记呢，就像是它的小标签。
这个标记可以是酶之类的东西。
接下来就更有趣啦。
当我们加入底物的时候，因为检测抗体上带着酶标记，这个酶就像一个小工匠，它会对底物进行加工。
底物被加工之后呢，就会发生一些变化，比如说变色啦。
我们就可以根据这个变化的程度来判断抗原的量。
如果颜色变得很深，那就说明抗原的量比较多；要是颜色浅，那抗原的量就少啦。
双抗体夹心ELISA方法可厉害了，它能够很灵敏地检测出抗原。
在医学上呀，它能检测出身体里是不是有病毒或者细菌的抗原，帮助医生判断病情。
在食品检测里呢，也能检测出有没有有害的微生物抗原，保障我们的食品安全。
反正这双抗体夹心ELISA方法就像一个小小的侦探，在微观的世界里，把抗原这个小目标给找出来，然后告诉我们它的情况呢。
是不是很神奇呀，宝子？ 。
ELISA-双抗夹心法检测抗原
3.封闭
1×Assay diluent， 200μl/孔加入到酶标板中，封 口膜封闭酶标板后，放入湿盒中，37℃避光孵育 2h。
37℃避光孵育2h
以上助教老师负责完成
4.洗涤 弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板4次，（将
• 从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用； • 试剂最好现配先用
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固相载体
• 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性 能；
• 国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式； • 已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-
8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。
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2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔； 3）空白对照：取100μl 1×Assay diluent加入酶标板，做复孔；
待测样品---- 经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清
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ELISA 操作要点
样品的保存 试剂的准备 固相载体 包被 加样 孵育(温育） 洗涤 显色和比色
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样本的制备与保存：
血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4℃， 超过一周，-80℃保存；
（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） ➢ 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法
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间接法检测特异性抗体
包被已知抗原
与待测抗体孵育
与酶标抗体孵育
加入底物
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显色
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优点:
1. 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测 相应抗体的方法
酶联免疫吸附试验(ELISA)
竞争法
此法可用于小分子抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。被 结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如 果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就 减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点 在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
掌握免疫标记技术的基本原理。 掌握三大免疫标记技术的工作原理及主要实验类型的
原理和方法。 熟悉ELISA试验的实验设计原理。 了解免疫标记技术的应用与发展。
酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
酶联免疫吸附试验
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫 测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。
HRP催化过氧化物的氧化反应。
供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波 长为492nm
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后， 由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm .TMB性质较稳定，可 配成溶液试剂，只需与H2O2溶液进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需 稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝 标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原 的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
捕获法 测IgM抗体
酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理
酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELIS A）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。
该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。
在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。
一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。
在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。
2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。
3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。
在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。
二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。
在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。
该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。
这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。
除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。
在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。
三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。
它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。
在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。
HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。
酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。
双抗体夹心法elisa原理
双抗体夹心法elisa原理小伙伴，今天咱们来唠唠这个双抗体夹心法ELISA的原理，可有趣啦。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定的简称，这双抗体夹心法ELISA就像是一场抗体的“三明治”制作大赛。
你看啊，咱们要检测的那个东西，比如说某种抗原，就像是三明治中间那块美味的肉。
那抗体呢，就是面包片啦。
先来说说这个抗体。
在这个检测里，有两种抗体哦。
第一种抗体是被固定在检测板上的，就像把一片面包稳稳地放在盘子里一样。
这个检测板就像是一个特殊的舞台，抗体就站在上面等着抗原的到来。
这个固定的抗体有个特殊的本领，它能特异性地识别咱们要检测的抗原。
什么叫特异性识别呢？就好比一把钥匙开一把锁，这个抗体就只能和咱们要检测的那种抗原紧紧结合，对其他乱七八糟的东西可没兴趣。
当咱们把含有抗原的样本加到这个有固定抗体的检测板上的时候，就像是把肉放在了面包片上。
抗原就会和固定的抗体来个亲密接触，它们紧紧地抱在一起，这个过程就像是命中注定的相遇一样。
这时候，抗原就被固定在检测板上啦。
接下来呢，第二种抗体就该登场啦。
这第二种抗体也是针对咱们要检测的抗原的，它就像是另一片面包，要把抗原夹在中间。
这个抗体可自由啦，在溶液里游来游去，当它发现检测板上已经被固定住的抗原的时候，就会迅速地结合上去。
这就形成了抗体 - 抗原 - 抗体这样的一个“三明治”结构。
是不是超级酷？但是呢，这还没完事儿哦。
咱们怎么知道这个“三明治”已经做好了呢？这就需要一点小魔法啦，这个第二种抗体上面还连接着一种酶呢。
这个酶就像是一个小信号员，它可以催化一种化学反应。
当我们加入一种特殊的底物的时候，这个酶就开始工作啦。
在酶的催化下，底物会发生变化，这个变化我们是可以看到的。
比如说，会产生颜色变化，就像变魔术一样，从无色变成有色。
颜色的深浅就和抗原的量有关系啦。
如果抗原很多，那形成的“三明治”就多，酶催化底物产生的颜色就深；要是抗原少呢，“三明治”少，颜色就浅。
你看，这个双抗体夹心法ELISA就像是一场精心编排的小剧场。
elisa法类型
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附测定）是一种常用的免疫学检测技术，用于定量或定性分析抗原或抗体。
根据不同的实验设计和应用，ELISA可以分为几种基本类型：1. 双抗体夹心法（Sandwich ELISA）：- 用于检测抗原。
- 包被抗体固定在微孔板上，待检样本中的抗原与包被抗体结合，然后加入酶标记的抗体，形成抗原-包被抗体-酶标记抗体复合物。
- 最后加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析抗原含量。
2. 间接法（Indirect ELISA）：- 用于检测抗体。
- 抗原固定在微孔板上，待检样本中的抗体与抗原结合，然后加入酶标记的抗体，形成抗原-待检抗体-酶标记抗体复合物。
- 最后加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析抗体含量。
3. 竞争法（Competitive ELISA）：- 用于检测小分子抗原。
- 抗原和酶标记的抗原竞争性地与固定在微孔板上的抗体结合。
- 加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析抗原含量。
4. 捕获法（Capture ELISA）：- 用于检测特定的抗原或抗体。
- 抗原或抗体被固定在微孔板上，待检样本中的相应物质与之结合。
- 加入酶标记的抗体或抗原，形成复合物。
- 最后加入底物并测定酶活性，根据颜色变化定量分析待检物质。
5. 斑点ELISA（Dot-ELISA）：- 类似于间接法，但使用硝酸纤维素膜作为固相载体，适用于检测抗体。
6. 块状ELISA（Block ELISA）：- 类似于双抗体夹心法，但在加入酶标记抗体之前，会加入一块状的抗体，以增强检测的特异性。
这些类型的ELISA可以根据实验的具体需求和条件进行选择和调整。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法是一种生物医学研究中常用的实验技术，它通过结合两种不同的抗体，能够更有效地检测或治疗特定疾病或病原体。
本文将详细介绍双抗体夹心法的原理及其应用。
一、双抗体夹心法概述双抗体夹心法（sandwich ELISA）是酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的一种类型。
它利用两种不同的抗体分别与目标分子结合，从而形成夹心复合物。
其中一种抗体被固定在试验板上，另一种抗体带有标记物，如酶或荧光染料，用于检测目标分子的存在。
通过测量标记物的信号强度，我们可以间接地评估目标物质的浓度或活性。
二、双抗体夹心法的原理基于两种抗体与目标分子的多重识别和结合。
在实验过程中，我们首先将一种抗体固定在试验板上，形成抗原捕获层。
这种抗体专门识别并结合特定的目标分子。
待固定完成后，加入待测样品，其中的目标分子会与捕获层上的抗体结合。
接下来，我们加入第二种抗体，这种抗体则与目标分子的另一个表位结合。
同时，这第二种抗体携带有标记物，例如酶。
在适当条件下，这两种抗体将形成一个“夹心”结构，即第一种抗体-目标分子-第二种抗体。
最后，我们添加染色底物或发光底物，使标记物生成可观察的信号。
标记物的性质根据实验需要而定，酶标记的双抗体夹心法一般使用酶底物产生比色反应，而荧光标记的双抗体夹心法则需要使用荧光显微镜或荧光分析仪进行检测。
通过测量信号的强度，我们可以间接地确定目标分子的浓度或活性水平。
三、双抗体夹心法的应用双抗体夹心法可广泛应用于生物医学研究、生物分析和临床诊断等多个领域。
以下列举几个常见的应用：1. 蛋白质检测：双抗体夹心法可用于检测血清中特定蛋白质的浓度，如肿瘤标志物、炎症介质等。
通过测量目标蛋白质的浓度变化，可以判断疾病的进展或治疗效果。
2. 病原体检测：双抗体夹心法可以用于检测病原体，如病毒、细菌或寄生虫等。
通过识别病原体特定的抗原或蛋白质，可以进行早期诊断和监测疾病治疗效果。
生物素双抗体夹心法酶联免疫吸附法
生物素双抗体夹心法酶联免疫吸附法
生物素双抗体夹心法酶联免疫吸附法(ELISA)是一种常用的免疫学技术，常用于检测血清中的蛋白质、病毒和细菌等分子。
该技术主要是通过特异性抗原-抗体反应来检测样品中的目标分子，并且具有高度敏感性和特异性，可用于诊断多种疾病。
ELISA技术主要是利用特异性的抗体与抗原发生反应，将所需细胞、病毒、蛋白、药物等固定在微量孔板上，然后经过成对的抗体反应，使用适配性标记检测物质检测，达到高灵敏度的检测效果。
在生物素双抗体夹心法ELISA中，目标物（如蛋白质）的抗体被钉在96孔板表面。
样品中的目标物与其抗体结合，并且未被结合的物质被洗掉。
然后，另一种特定的抗体被添加到96孔板中，与样品中的目标物结合。
这种抗体是由生物素标记的，使其具有生物素分子上的亲和力。
接下来，用另一个抗体结合辣根过氧化物酶，它可以由另一种二抗体与生物素抗体结合而形成二抗体复合物。
最后，用亚甲基硫酸酯（TMB）溶液作为基质，它会在酶作用下转变为蓝色反应产物，然后加入硫酸停止反应，以测定样品的光密度。
生物素双抗体夹心法ELISA的优点是高度敏感性、灵敏度和特异性高，并且它能够检测到低浓度的目标物；这种方法不需要很多样品量，可以适用于多个样品测试；同时该技术还具有检测速度快、结果准确、重复性好等优点。
但该方法有一些局限性，例如有可能存在局限性和测量范围有限等问题。
总之，生物素双抗体夹心法ELISA技术可以被广泛应用于动物和人的免疫学研究，以及临床诊断和治疗方面，例如用于检测HIV、肝炎、白血病等多种疾病，已成为免疫诊断技术的重要组成部分。
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（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）
“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对 照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：
待检标本
阳性对照
阴性对照
• （一）免疫标记技术
【概念或原理】： 利用荧光素、酶、胶体金、发光物 质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已 知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或 抗体的量或其存在与否。
6
tubercle bacillus with fluorescence
8
酶免疫技术
酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体
ELISA (酶联免疫吸附试验，enzyme-linked immunosorbent assay) sandwich ELISA to detect Ag √ indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ab or Ag
Sandwich ELISA (to detect Ag, 双抗体夹心法，原理)
1）已知抗体包被 2）洗板 3）加待检抗原标本 4）洗板 5）加酶标记抗体 6）洗板 7）加底物显色，测定
(measure color)
（封闭的意义）
( Ag )
polystyrene ( no Ag )
（显色） （定量）
6. 洗涤单个核细胞2次(加入约1ml Hanks’ 液, 混匀，离心，1500或2000rpm，5min，倒 去上清；重复1次)；
7. 用残留上清(或加Hanks’ 液约0.1ml)重悬获 得的单个核细胞，备用；
8. 吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片 上，显微镜下观察单个核细胞（以淋巴细 胞为主）
医学免疫学实验
实验三
• （一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法） 2、斑点免疫层析试验
• （二）免疫细胞的分离与纯化 1.密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
（含淋巴细胞）
• （三）免疫细胞功能测定 1、E玫瑰花环试验（示教） 2、淋巴细胞转化试验（示教）
（四）结核病相关的免疫试验简介
• 2）外周血单个核细胞包括淋巴细胞和 单核细胞，可进一步分离得到淋巴细胞。
抗凝血 分离液
离心前
血浆层
单个核细胞层
（白色云雾状，薄层）
分离液
红细胞、粒细胞
离心后
Main method:
• Anticoagulated blood are layered
on the top of Ficoll (lymphocyte
23
[方法]
1. 每桌（4人，2组）准备抗凝血1份（约 4ml）；（已做，用前混匀）
2. 将分层液（淋巴细胞分离液）加入试 管（已做）
3. 每组用吸管吸取肝素抗凝血约2ml缓慢 加在淋巴细胞分离液之上（沿试管壁 缓慢加入）；
4. 水平离心(2000rpm, 20 min)；
[方法]
5. 将吸管轻插至淋巴细胞层，沿试管壁周缘 轻轻吸取上下液界面间的单个核细胞层， 置另一干净试管内；
（不显色）
10
（一）免疫标记技术
1、酶联免疫吸附试验 (ELISA)
------双抗体夹心法
• 请按照实验指导讲义方法进行操作， 第5-9步；
• 第5、7步孵育时间由60min改为30min； • 结果肉眼判断 • 第5步按下页PPT的图加样，加6个孔，
37℃，30分钟，（实验课开始时已做， 接着做第6步，洗板）
separation medium),
• horizontal centrifugation, • Four layers: plasma, lymphocytes,
Ficoll, granulocytes and red blood
cells;(figure)
• Collect lymphocytes.
• 请按照实验指导讲义方法进行操作， 并判断结果，
（二）免疫细胞的分离与纯化
1. 密度梯度离心法分离外周血 单个核细胞（含淋巴细胞）
（二）1. 外周血单个核细胞的分离 密度梯度离心法
• [原理]
• 1）人外周血中红细胞、粒细胞密度 1.092左右，单个核细胞为1.075~1.090。 根据各类血细胞比重的差异，分离得到 单个核细胞。
特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素）
固相特异性抗体（抗HCG）
固相抗小鼠IgG抗体
16
• 阳性：T区、 R（或C）区均出现红 色线条（两条红线）；
• 阴性：T区不出现红色线条，仅R （或C）区出现红色线条（一条红 线）。ive
invalid
18
（一）2、斑点免疫层析试验
Lymphocytes (淋巴细胞)
Lymphocytes, cancer cells? 淋巴细胞（淋巴癌？）
lymphocyte
normal small lymphocyte in blood smear (血片中淋巴细胞)
small lymphocytes (cancer cells) in non-Hodgkin’s lymphoma 小淋巴细胞（非霍奇金小淋巴细胞淋巴瘤）
DICA)
the "rapid tests" that you might use to detect pregnancy, or diagnose an infection quickly in a doctor's office.
(Nitrocellulose membrane)
B
C
T
R
A
金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG）
【分类】 荧光免疫技术 酶免疫技术→ELISA（双抗体夹心法 ） 放射免疫技术 金免疫技术→斑点免疫层析试验 化学发光免疫技术等
免疫标记技术举例：
（？） Ag ＋ Ab 荧光素
Ag－Ab－荧光素 （细胞表面可见荧光）
＋ Ab 荧光素
＋ Ab－荧光素
（洗涤）
cells with fluorescence
（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）
“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对 照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：
待检标本
阳性对照
阴性对照
( Indirect ELISA to detect Ab )
13
14
（一）2、斑点免疫层析试验 (dot gold immunochromatographic assay，