酶联免疫吸附试验双抗体夹心法

（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）
“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对 照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：
待检标本
阳性对照
阴性对照
• （一）免疫标记技术
【概念或原理】： 利用荧光素、酶、胶体金、发光物 质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已 知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或 抗体的量或其存在与否。
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tubercle bacillus with fluorescence
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酶免疫技术
酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体
ELISA (酶联免疫吸附试验，enzyme-linked immunosorbent assay) sandwich ELISA to detect Ag √ indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ab or Ag
Sandwich ELISA (to detect Ag, 双抗体夹心法，原理)
1）已知抗体包被 2）洗板 3）加待检抗原标本 4）洗板 5）加酶标记抗体 6）洗板 7）加底物显色，测定
(measure color)
（封闭的意义）
( Ag )
polystyrene ( no Ag )
（显色） （定量）
6. 洗涤单个核细胞2次(加入约1ml Hanks’ 液, 混匀，离心，1500或2000rpm，5min，倒 去上清；重复1次)；
7. 用残留上清(或加Hanks’ 液约0.1ml)重悬获 得的单个核细胞，备用；
8. 吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片 上，显微镜下观察单个核细胞（以淋巴细 胞为主）
医学免疫学实验
实验三
• （一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法） 2、斑点免疫层析试验
• （二）免疫细胞的分离与纯化 1.密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
（含淋巴细胞）
• （三）免疫细胞功能测定 1、E玫瑰花环试验（示教） 2、淋巴细胞转化试验（示教）
（四）结核病相关的免疫试验简介
• 2）外周血单个核细胞包括淋巴细胞和 单核细胞，可进一步分离得到淋巴细胞。
抗凝血 分离液
离心前
血浆层
单个核细胞层
（白色云雾状，薄层）
分离液
红细胞、粒细胞
离心后
Main method:
• Anticoagulated blood are layered
on the top of Ficoll (lymphocyte
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[方法]
1. 每桌（4人，2组）准备抗凝血1份（约 4ml）；（已做，用前混匀）
2. 将分层液（淋巴细胞分离液）加入试 管（已做）
3. 每组用吸管吸取肝素抗凝血约2ml缓慢 加在淋巴细胞分离液之上（沿试管壁 缓慢加入）；
4. 水平离心(2000rpm, 20 min)；
[方法]
5. 将吸管轻插至淋巴细胞层，沿试管壁周缘 轻轻吸取上下液界面间的单个核细胞层， 置另一干净试管内；
（不显色）
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（一）免疫标记技术
1、酶联免疫吸附试验 (ELISA)
------双抗体夹心法
• 请按照实验指导讲义方法进行操作， 第5-9步；
• 第5、7步孵育时间由60min改为30min； • 结果肉眼判断 • 第5步按下页PPT的图加样，加6个孔，
37℃，30分钟，（实验课开始时已做， 接着做第6步，洗板）
separation medium),
• horizontal centrifugation, • Four layers: plasma, lymphocytes,
Ficoll, granulocytes and red blood
cells;(figure)
• Collect lymphocytes.
• 请按照实验指导讲义方法进行操作， 并判断结果，
（二）免疫细胞的分离与纯化
1. 密度梯度离心法分离外周血 单个核细胞（含淋巴细胞）
（二）1. 外周血单个核细胞的分离 密度梯度离心法
• [原理]
• 1）人外周血中红细胞、粒细胞密度 1.092左右，单个核细胞为1.075~1.090。 根据各类血细胞比重的差异，分离得到 单个核细胞。
特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素）
固相特异性抗体（抗HCG）
固相抗小鼠IgG抗体
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• 阳性：T区、 R（或C）区均出现红 色线条（两条红线）；
• 阴性：T区不出现红色线条，仅R （或C）区出现红色线条（一条红 线）。ive
invalid
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（一）2、斑点免疫层析试验
Lymphocytes (淋巴细胞)
Lymphocytes, cancer cells? 淋巴细胞（淋巴癌？）
lymphocyte
normal small lymphocyte in blood smear (血片中淋巴细胞)
small lymphocytes (cancer cells) in non-Hodgkin’s lymphoma 小淋巴细胞（非霍奇金小淋巴细胞淋巴瘤）
DICA)
the "rapid tests" that you might use to detect pregnancy, or diagnose an infection quickly in a doctor's office.
(Nitrocellulose membrane)
B
C
T
R
A
金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗HCG）
【分类】 荧光免疫技术 酶免疫技术→ELISA（双抗体夹心法 ） 放射免疫技术 金免疫技术→斑点免疫层析试验 化学发光免疫技术等
免疫标记技术举例：
（？） Ag ＋ Ab 荧光素
Ag－Ab－荧光素 （细胞表面可见荧光）
＋ Ab 荧光素
＋ Ab－荧光素
（洗涤）
cells with fluorescence
（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）
“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对 照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：
待检标本
阳性对照
阴性对照
( Indirect ELISA to detect Ab )
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（一）2、斑点免疫层析试验 (dot gold immunochromatographic assay，