淋病的实验室检测

淋病的实验室检测

[日期：2004-09-17] 来源：labcn论坛作者：未知九月菊转[字体：大中小] 实验室检查：

淋球菌实验室检查包括涂片，培养检查淋球菌、抗原检测，药敏试验及PPNG测定，基因诊断。

（一）涂片检查：

取患者尿道分泌物或宫颈分泌物，作革兰氏染色，在多形核白细胞内找到革兰氏阴性

双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者，此法阳性率在90%左右，可以初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为50-60%，且有假阳性，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少，阳性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高检出率。

咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病，因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群。另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查。[dvnews_page=培养检查]

（二）培养检查：

淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，只要培养阳性就可确诊，在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer-Martin（TM）培养基和New

York City（NYC）培养基。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基，均含有抗生素，可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃，70%湿度，含5%-10%CO2（烛缸）环境中培养，24-48小时观察结果。培养后还需进行菌落形态，革兰氏染色，氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。培养阳性率男性80%-95%，女性80-90%。[dvnews_page=抗原检测]

（三）抗原检测

1．固相酶免疫试验（EIA）：可用来检测临床标本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用，可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。

2．直接免疫荧光试验：通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免

疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高，特异性差，加之实验人员的判断水平，故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。[dvnews_page=基因诊断]

（四）基因诊断

1．淋球菌的基因探针诊断

淋球菌的基因探针诊断，所用的探针有：质粒DNA探针，染色体基因探针和rRNA基因探针。

（1）质粒DNA探针

① 隐蔽质粒DNA探针，淋球菌质粒分为三种：接合性质粒，分子最大，为36kb

DNA；耐药性质粒包括两个质粒，DNA长分别为5.6kb和7.1kb；隐蔽质粒4.2kb。其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中，其它奈瑟菌不含有此质粒，故可用它的序列作为特异DNA 探针检测淋球菌。Torres采用核酸杂交技术检测淋球菌，所用探针为隐蔽质粒。用该探针对13 4株淋球菌和131株相关菌株的检测，有124株淋球菌杂交反应阳性，占93%，还可与个别其它的奈瑟菌出现交*反应，对测定探针的敏感性实验表明可检出102CFU淋球菌。研究证明隐蔽质粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色体中（包括不含该质粒的菌株）。因此CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性。Torres等用CPPB基因探针检测了201份临床标本，

采用非放射性地高辛标记系统，其敏感性和特异性分别为95%和98%。

②耐药性质粒DNA探针

淋球菌的抗药质粒可分为：①产青毒素酶淋球菌（PPNG）其β-内酰胺酶阳性；②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌（TRNG）。

PPNG菌株是1976年首次在实验室分离得到的，该菌中含有编码产青毒酶的基因，该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒DNA中，而后者居多，称之为产青毒素酶质粒，质粒有二种，大小分别为7.4kb和5.3kb。Pescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码β-内酰胺酶基因的探针，采用酶化学发光法标记，液相杂交，用测光计测是特异杂交体的光量。在4h内可检测104-105C FU的PPNG菌株。TRNG菌株虽对四环素耐药，但通常对β-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感。因此，在实验室药敏检测中可归为敏感细菌。Pescador用抗四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针,该基因介导抗四环素,用酶化学发光标记,液相杂交,4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

2)染色体探针

染色体探针包括已知功能的基因探针，如菌毛DNA探针和paI基因探针，这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用；未知功能的基因探针，这些探针序列与染色体的特定序列互补，但目前还不知这些基因序列的功能。以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低，检测灵敏度较低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。

（3）rRNA基因探针

rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针，该探针的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探针的特点是：①可以增加探针检测的灵敏度，rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子；

②rRNA具有进化上的保守性；③杂交方法简便、快速；④由于rRNA的含量较高，标本不需增菌。美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACE

C，是以rRNA 及其基因为检测靶序列，采用放射性标记，在2h内可以完成检测，Peter用这种探针检测395个临床标本，结果灵敏度和特异性分别为92.9%，99.4%，他认为PACE

C系统筛查临床标本中淋球菌是一个可*的方法。该探针还可以检测无症状淋球菌感染者，这是目前培养难于达到的。

2、淋球菌的基因扩增检测

上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法，虽然比培养方法在灵敏度，特异性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高，PCR技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性，它具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可以直接检测临床标本中极微量的病原体。

（1）淋球菌DNA的提取

①培养菌的DNA提取

将培养得到的淋球菌，以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解，裂解液组成为：1M

NaCl 1M NaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。将裂解液混匀后煮沸1min，然后用100μl

的1M Tris pH7.0中和碱性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次，酚—氯仿抽提一次，然后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，提取的DNA溶于30μl蒸馏水或TE缓冲液中。

②临床棉拭子标本的提取

将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或PBS缓冲液中挤压洗1min，以便将标本尽量溶于溶液中，将棉拭子弃去，悬浮液于2-3000r/min离心5min，吸去上清液，细胞重新溶于10 0μl

1×PCR缓冲液，其中含Tween 20 0.45%,蛋白酶K 200μg/ml，细胞悬浮液于50-60℃温浴1h,然后95℃加热10min以灭活蛋白酶K,12000

r/min离心10min,上清液含DNA模板。

（2）PCR引物的设计

由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在，同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒，因此很多PCR引物设计在CPPB基因区。

靶基因

引物序列

片段长度（bp）

CPPB NG1

5′GTT TGG CTG GTT GAT TCA AG 3′