感染性疾病的实验室诊断

感染性疾病的实验室诊断感染性疾病的实验室诊断介绍实验室检查可直接对微生物进行检测（如：肉眼观察、利用显微镜观察、病原体在培养基上生长）或者间接对微生物进行检测（如抗体检测）。

一般的检测手段包括·显微镜检查( 显微镜检查)·培养(培养)·免疫学试验（凝集反应试验如乳胶凝集试验、酶免疫测定、蛋白质印迹、沉淀试验、补体结合试验）免疫学试验·核酸为基础的鉴定方法( 以核酸为基础的鉴定方法)·非核酸鉴定方法( 以非核酸为基础的鉴定方法)培养通常是明确微生物的金标准，但是结果可能要在数天或数周后才能得到，并且不是所有的病原体都可以通过培养得到，因此可以选择其他有参考价值的试验。

当一种病原体得到培养及鉴定后，实验室就可以评估其对抗微生物药物的敏感性药敏试验。

有时也可以用分子生物学的方法来检测特定的耐药基因。

一些试验（如革兰染色，常规的需氧培养）可以检出多种病原体，并且通常在许多可疑的感染性疾病的诊断中被使用。

然而由于通过这些试验可能使得一些病原体被遗漏，因此临床医生必须知道对每种可疑病原体检测所用的每个试验的局限性。

当出现可能被遗漏的情况时，医生需要对怀疑的病原体进行特异性的检测（如特异染色或特异培养基）或建议实验室选择更多有针对性的试验进行检测。

显微镜检查显微镜检查速度快，但是准确性有赖于检测者的经验以及检测设备的质量。

除标准的实验室外，由于质控方面的不足常常限制了医生选择显微镜检查作为确诊的方法。

组织的显微镜检查可能需要区分病原微生物来自于侵袭性疾病或仅仅为表面定植－这种区分往往难以由培养来判别。

虽然有一些不能被染色的标本要通过水分固定来检出真菌、寄生虫（包括蠕虫的卵和幼虫）、阴道来源细胞和能动的微生物（如毛滴虫属）、梅毒螺旋体（通过暗视野显微镜），但是大多数标本用染剂处理后都能使病原体带有颜色，让它们在背景中突显出来。

为了提高真菌的可分辨度，可用10%氢氧化钾（KOH）溶解周围的组织和非真菌病原体。

虽然不被染色也是100%具有特异度的，但是临床医生还是以推测可能的病原体来要求所选用的染剂。

大多数样本用革兰染剂染色，如果怀疑是分枝杆菌则要选用抗酸染剂。

然而有一些病原体使用这些染剂则不能被轻易观察到；如果怀疑是此类病原体，需要使用不同的染剂或采用其他可以进行鉴定的方法。

因为显微镜检查时通常要求标本中微生物的浓度达到1 ×104-5/mL，所以许多体液标本（如CSF，尿液）在进行检查前需进行浓缩处理（如离心法）。

革兰染色革兰染色是通过细菌能保留紫色晶体染剂（革兰阳性——蓝色）或不能保留（革兰阴性——红色）以及细胞的形态学（如杆菌或球菌）和细胞的排列（如：丛状、链状、二倍体）来将细菌分类。

可以根据这些特征最终确定抗生素治疗方案。

用革兰染色后的形态及染色特征来发现病原微生物的方法可鉴定出多种细菌感染。

革兰染色是将标本通过热固定于载玻片上，相继用革兰紫色晶体、碘、脱色剂和复染剂（具有代表性的是番红精）处理。

抗酸染色和改良抗酸染色这些染色法用于鉴定“抗酸”微生物（分枝杆菌类）和“中等抗酸”微生物（主要是放线菌类）。

除了用于一些寄生虫的囊合子（如隐孢子虫）外，它们也用于红线菌属以及和其有关菌属的染色。

分枝杆菌在痰液中的含量达到10 000个／ml就能被检测出，但是因为它常常在标本中以更低的浓度水平存在，检测的灵敏度因此受限。

通常几毫升的痰液在氢氧化钠去污染后经过离心浓缩才被用于抗酸染色。

尽管一些中等抗酸的微生物很难从分枝杆菌中区分出来，但是这种方法的特异度仍较可信。

荧光染色这些方法可用于更低浓度的标本（<1×104细胞数/mL）的检测。

具体例子包括吖啶氮蒽橙色荧光（细菌和真菌），金胺-玫瑰红和金胺O荧光（分枝杆菌），白色含钙荧光（真菌，尤其是皮肤癣菌）。

病原菌抗体和荧光剂偶联（直接或间接免疫荧光）理论上可以提高检测的灵敏度和特异度。

然而由于这些试验结果的解读和解释有一定的困难，因此商业上仅极少数方法有利用价值而常规使用（如肺孢菌和军团杆菌属直接荧光抗体试验）。

印度墨汁（胶态碳）染色这种方法用于检测那些有细胞悬浮的体液（如CSF沉淀物）中主要含有新型隐球菌和其他具有包囊的真菌标本。

该方法主要是使背景视野被染色而不是微生物本身被染色，染色后使微生物的荚膜呈晕轮状而易被观察到。

在CSF中其灵敏度不如隐球菌抗原检测。

特异度也受到限制：白细胞也可能呈现包囊状。

Warthin-Starry银染法和Dieterle 染色这些银染色用于显现如螺旋体,幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）, 微孢子虫和巴尔通氏体（Bartonella henselae）（猫抓病的病原）等细菌。

赖特染色和吉姆萨染色这两种方法用于检测血液中的寄生虫，吞噬细胞和组织细胞中的荚膜组织胞浆菌，细胞内由病毒和衣原体所形成的包涵体，耶氏肺孢菌的滋养体，以及一些细胞内细菌。

三色染色（果莫里-Wheatley染色）和铁苏木精染色这些染色方法用于检测肠道内的原虫。

果莫里-Wheatley染色用于检测微孢子虫。

它可能遗漏蠕虫卵和幼虫，并且用于检测隐孢子虫也不可靠。

真菌和人的细胞会被染色。

铁苏木精染色可以鉴别染色的细胞、细胞包含物和细胞核。

当用于对蠕虫卵进行染色时，应避免染得太深而难以检测。

培养培养是指微生物在一种有营养的固体或液体培养基上面或里面生长，使得微生物的数量增加从而更利于鉴定。

培养也可以更加容易进行抗微生物制剂敏感性试验。

临床和实验室进行交流是必要的。

虽然大多数标本都接种于普通培养基上（如血或巧克力琼脂），但是一些病原菌的培养需要包含有特殊的营养成分和抑制剂或者需要其他特殊的条件（分离常见细菌所选用的培养基）；如果怀疑是这些病原菌中的一种或者患者已经接受抗微生物制剂的治疗，应该将这些情况告知实验室。

告知实验室标本的来源有利于实验室根据特殊部位常见的菌群区分病原菌。

标本的采集非常重要。

在感染性疾病的诊断中，在感染部位采集标本是主要原则。

应该在病变前缘，而不是中心，进行采样。

拭子的使用令人气馁。

然而，如果需要使用一个拭子，植绒拭子应该被优先选，因为它可以获取更多的标本。

用于分子学检测方法的拭子（以核酸为基础的鉴定方法）必须同其将被使用的特定检测方法相匹配。

选择错误类型的拭子可产生假阴性。

木柄拭子不利于某些病毒生存；棉签拭子对于一些细菌和衣原体是有毒的。

血培养标本采集时需要对皮肤进行清洁和消毒（如聚维酮碘药签消毒、干燥，再用70%的乙醇脱碘）。

常常需要从多个不同的部位留取多份样本，如果可能应该在发热达到高峰时留取标本。

仅仅在一份血样本中有皮肤和黏膜常见菌群生长说明是污染造成的。

如果一份血液样本是从深部留置管获得，那么也应该再留取一份外周血管血液标本，这样有助于区分是全身性的菌血症还是导管相关性感染。

来自感染导管中的标本培养结果与同时来自外周血管的血标本培养结果相比较，通常阳性结果出现较快，并且包含有较多种微生物。

部分真菌，特别是霉菌（如曲霉类），通常不能通过血培养获得。

为了尽量限制可能造成污染的正常菌群的生长，样本必须以最快的速度接种于适宜的培养基中。

为了精准确定病原体的数量，应尽量防止其他病原体的生长；应该立即将样本运送至实验室，若可能耽误接种，则可先将样本进行冷冻（在多数情况下）。

某些病原培养需要特殊的条件。

厌氧菌不应该从正常菌群的部位留取样本进行培养，因为不可能做到从正常菌群中区分出病原菌。

样本必须隔绝空气，做到该点颇为困难。

对于用拭子采集的样本，可以利用厌氧培养基运送。

然而，对于厌氧菌的培养，液体标本（如脓肿内容物）优于拭子标本。

液体标本应该用排空空气的注射器收集（以尽可能减少标本与氧气的接触），装在注射器（去除针头并盖好针帽）或转移至厌氧菌瓶中送到实验室。

分枝杆菌属培养有相当困难。

含有正常菌群的样本必须首先进行去污和浓缩。

结核分枝杆菌和一些其他的分枝杆菌生长缓慢。

通常结核分枝杆菌在液体培养基中的生长速度快于在固体培养基中。

常规使用的采用液体培养基的自动系统能够在2周内得到结果，而使用固体培养基如Lowenstein-Jensen琼脂的则需要≥4周的时间。

此外，在样本中可能只含有极微量的微生物。

同一部位留取多份样本有助于最大限度获得阳性结果。

在将标本丢弃前应该给予8周时间进行培养。

若怀疑为非常见的分枝杆菌，事先应该告知实验室。

病毒通常将来自拭子和组织的标本接种于含有抗细菌和抗真菌物质的培养基中培养。

将标本接种于组织培养物上，该培养物支持可疑的病毒生长而抑制所有其他微生物生长。

病毒（如水痘带状疱疹）具有高度的不稳定性，应该在采集后1小时内接种于组织培养物上。

标准的组织培养是最敏感的。

瓶内病毒培养可能更快地提供结果。

通过常规的培养方法不能检出某些病毒，需要选择其他的方法加以明确（如用酶免疫测定法检测EB病毒、乙肝和戊肝病毒、HIV、人T-淋巴细胞病毒；用血清学试验检测甲肝和丁肝病毒；以核酸为基础的方法检测HIV）。

EIA=酶联免疫测；EM=电子显微镜检；IEM=免疫电子显微镜检查；IFA=免疫荧光测定法。

必须将真菌样本接种于含有抗细菌物质的培养基上。

在标本被丢弃前，应该给予其3到4周的培养时间。

药敏试验药敏试验是通过将一种微生物浓缩后使其与特定的经过浓缩的抗微生物药物接触，以确定该抗微生物制剂针对该种微生物的易损性。

药敏试验可用于细菌、真菌和病毒。

对于一些微生物来说，通过对一种药物所获得的结果可以预测与其类似药物的试验结果。

因此，无需对所有的现存药物都进行试验。

药敏试验在体外进行，因此在体内可能影响治疗成功与否的因素没被考虑在内（如药效学和药代动力学、特定部位的药物浓度、宿主的免疫状态、特定部位宿主的自我防御机制）。

因此，药敏试验的结果不是总能预测治疗效果。

药敏试验可以通过定性法、半定性法或者用以核酸为基础的方法进行。

试验也能测定不同的抗微生物制剂组合后的疗效（增效试验）。

定性法定性法的准确性较定量法差。

结果通常被报告为：·敏感·中介·耐药一些尚未建立耐药标准的菌株可能仅被报告为敏感或不敏感。

建立起表示S，I和R的具体药物浓度基于多种因素，特别是药代动力学，药效学，临床和微生物学数据。

对于生长速度快的微生物，通常适合使用圆盘扩散法（也被称为Kirby-Bauer试验）进行试验。

该方法是将浸透有抗生素的圆盘放置于已经接种了待检测微生物的琼脂平板上。

接种后（标准的为16～18小时后），测量每一个圆盘周围因抑制微生物生长而产生区带的直径大小。

根据每一微生物-抗生素组合所显示的直径大小而分别表示为S、I或R。

其他的一些不需要进行牢固黏附的试验方法可用于单一微生物对单一药物耐药、或对一类药物耐药、或对特定的抗微生物复合制剂耐药（如甲氧西林耐药并产生β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药）的快速筛查。