双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
DNA测序测序方法双脱氧链终止法自动化DNA测序焦磷酸测序1
DNA 测序测序方法：双脱氧链终止法自动化DNA测序焦磷酸测序1、双脱氧链终止法原理：ddNTP由于缺乏3’-OH ，可以终止DNA链的延长利用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将不同长度的核苷酸链分离步骤：（1）双链DNA-------加热----------单链DNA（2）加引物--------退火（3）取四支试管A、B、C、D加入dNTP、耐热的DNA聚合酶（4）将ddNTP标记，A加入ddATP、B加入ddTTP、C加入ddCTP、D加入ddGTP（5）得到结构如下5’—X—A*5’—X—AG*5’—X—AGG*5’—X—AGGC*5’—X—AGGCT*5’—X—AGGCTA*5’—X—AGGCTAG*5’—X—AGGCTAGC*5’—X—AGGCTAGCA*5’—X—AGGCTAGCAG*5’—X—AGGCTAGCAGC*5’—X—AGGCTAGCAGCA*5’—X—AGGCTAGCAGCAT*5’—X—AGGCTAGCAGCATG*5’—X—AGGCTAGCAGCATGA*（6）用尿素处理变性的聚丙烯凝胶电泳，依次读出核苷酸序列2、自动化DNA测序原理：(1)用四种不同的荧光染料分别标记不同的ddNTP(2)在同一试管中加入ddNTP、NTP、DNA单链-引物、DNA聚合酶(3)生成的系列单链DNA片段在琼脂糖凝胶进行电泳(4)用光子检测器接受被激光激发的DNA上的标记荧光素发出的光子，因生成的DNA依据片段由短到长依次经过，便可得到待测DNA的核苷酸序列3、焦磷酸测序原理：（1）将单一链DNA-引物、DNA聚合酶、ATP硫酶化酶、荧光素酶、荧光素、APS加入试管（2）加入一种dNTP，如果其为合成下游核苷酸所需要的核苷酸种类，则发生反应生成PPi（3）P pi在ATP硫酶化酶作用下生成ATP（4）A TP在荧光素氧化酶的作用下将荧光素氧化生成氧化荧光素（5）氧化荧光素释放光子恢复形成荧光素，（6）剩余的dNTP在APS作用下继续分解（7）加入另一轮dNTP，进行新一轮反映。
dna双脱氧末端终止法名词解释
DNA双脱氧末端终止法一、引言DNA双脱氧末端终止法（DNA double-stranded termination method），又称为Sanger测序法（Sanger sequencing），是一种经典的测序技术，于1977年由Frederick Sanger等人首次发表。
它是一种利用DNA聚合酶合成DNA链过程中的特殊终止作用分析DNA序列的方法。
本文将从原理、步骤、优缺点等方面对DNA双脱氧末端终止法进行详细的解释和探讨。
二、原理DNA双脱氧末端终止法基于DNA聚合酶的特殊性质，即当DNA聚合酶在合成DNA链过程中遇到双脱氧末端核苷酸（ddNTP）时，合成过程会终止。
与普通核苷酸（dNTP）不同，双脱氧末端核苷酸缺少3’位的羟基，无法连接到新的核苷酸，导致DNA链的延伸终止。
根据不同的碱基，分别使用带有不同荧光标记的ddNTP，例如A荧光标记的ddATP、C荧光标记的ddCTP、G荧光标记的ddGTP和T荧光标记的ddTTP。
将DNA模板与DNA聚合酶、引物、dNTP和ddNTP一起反应，可以合成出含有不同长度的DNA片段。
通过将反应产物进行电泳分离，并利用自动DNA测序仪检测不同荧光标记的信号，就可以得到DNA序列。
三、步骤DNA双脱氧末端终止法包括以下主要步骤：1. PCR扩增首先需要从待测DNA样本中进行PCR扩增，以获得足够数量的DNA模板。
PCR扩增可以使用特定引物选择性地扩增目标DNA片段，增加检测的敏感性和特异性。
2. 反应体系制备在反应管中将PCR产物与适量的DNA聚合酶、引物、dNTP和荧光标记的ddNTP混合，制备合适的反应体系。
其中不同颜色荧光标记的ddNTP分别代表A、C、G和T。
3. DNA链合成将反应体系进行热循环反应，通过不断提高和降低温度，使DNA链聚合酶合成DNA 链。
在这个过程中，当聚合酶遇到带有荧光标记的ddNTP时，会发生终止，形成不同长度的DNA片段。
sanger测序的原理和步骤
Sanger测序，也被称为双脱氧链终止法，是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。
以下是其原理和步骤：
原理：
Sanger测序基于DNA聚合酶的DNA合成过程，通过添加双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）来终止DNA链的延伸，从而得到一系列不同长度的DNA片段。
ddNTP与普通dNTP的区别在于其3′端缺少一个羟基，这使得ddNTP在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。
通过在反应中加入四种不同的ddNTP，可以得到包含不同长度的DNA片段，从而揭示出DNA分子中核苷酸的顺序。
步骤：
DNA模板制备：从待测序的DNA样品中提取出目标DNA片段，并进行PCR扩增，得到足够的DNA模板。
DNA合成反应：在PCR扩增反应中，加入四种不同的dNTP和一种ddNTP。
由于ddNTP可以随机地终止DNA链的延伸，因此可以得到一系列不同长度的DNA片段。
电泳分离：将得到的DNA片段进行电泳分离，使不同长度的DNA 片段得以分离。
检测：通过放射自显影等技术对电泳结果进行检测，从而确定DNA 序列。
双脱氧法测序的原理
双脱氧法测序的原理双脱氧法测序是一种常用的DNA测序技术，也是现代生物学和基因组学研究的重要工具之一。
本文将详细介绍双脱氧法测序的原理、步骤和应用。
一、双脱氧法测序的原理DNA序列是生物遗传信息的重要组成部分，而DNA测序就是确定DNA序列的过程。
双脱氧法测序是一种基于化学反应的DNA测序技术，其原理基于DNA的复制过程中的碱基互补特性和DNA聚合酶的活性。
DNA复制是生物体内的一个常见过程，其过程中DNA聚合酶通过读取DNA模板链的信息，将新的DNA链合成与模板链互补的链。
在DNA聚合过程中，DNA聚合酶会选择一种特定的核苷酸（dNTP）与DNA 模板链上的碱基进行互补配对，并将其加入到正在合成的新链中。
当DNA聚合酶遇到一个双脱氧核苷酸（ddNTP）时，它将无法进一步添加新的核苷酸，从而终止DNA链的合成。
双脱氧核苷酸是一种特殊的核苷酸，其分子结构与普通的核苷酸相似，但它缺少一个羟基（OH）基团。
这个羟基基团是DNA聚合酶在合成DNA链时所需要的，如果缺少了这个基团，DNA聚合酶就无法将新的核苷酸添加到DNA链中。
因此，当双脱氧核苷酸被加入到DNA合成反应中时，它会导致DNA链的终止，从而生成一系列不同长度的DNA片段。
利用这种原理，科学家可以将DNA模板链与DNA聚合酶和一定浓度的dNTP和ddNTP加入到反应体系中，然后通过一系列的化学反应，将DNA片段分离并进行测序。
具体来说，测序过程可以分为四个步骤：DNA片段的制备、DNA片段的分离、DNA片段的扩增和DNA片段的检测。
二、双脱氧法测序的步骤1. DNA片段的制备在双脱氧法测序中，需要制备一定长度的DNA片段，以便进行测序。
这些DNA片段可以通过多种方法获得，例如使用限制性内切酶或PCR扩增等技术。
一旦得到了合适的DNA片段，就可以将其与DNA聚合酶和dNTP和ddNTP一起加入到反应体系中。
2. DNA片段的分离在反应体系中，DNA片段会被随机地终止，并产生一系列不同长度的DNA片段。
掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。
由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。
本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。
实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。
每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。
但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。
例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。
将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。
其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。
由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。
故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。
[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。
(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。
2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因序列拼接和分析PPT课件
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合 物全部平行地点加在 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳， 每组制品中的各个组 分将按其链长的不同 得到分离，从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 基序列。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
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实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质技术主要有两种方法，都是 在20世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸 链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产 生切口，用同位素标记进行测序。
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2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上
述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷 三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然 后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机 地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继 续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A 就终止了。
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双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
双脱氧终止法的原理(一)
双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。
它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。
•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。
2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。
这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。
dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。
•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。
反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。
•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。
DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。
•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。
•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。
碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。
电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。
•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。
•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。
3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。
•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。
DNA sequence
�
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Dye terminator reactions
- the primer is not labeled with a dye - the dye is attached to the dideoxynucleotide, so whenever a ddNTP is added by the polymerase, the fragment is labeled according to the ddNTP at the end -since labeling occurs with the addition of the ddNTP, only one reaction per template is needed
3.测序反应的种类
① 引物标记法(Dye primer reactions)
② 终止物标记法(Dye terminator reactions)
Dye primer reactions
-fluorescent dye( label) on the primer, one specific dye for each nucleotide to be identified (A, C. G, T) -four separate reactions couple each specific primer with the corresponding ddNTP
序列测定 第9章 DNA序列测定 章 序列
遗传与分子生物学系 于杰 yujie19601117@
DNA 序列测定方法
1. Sanger 双脱氧链终止法 2. Maxam-Gilbert 化学修饰法
第一节 Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method)
Sanger双脱氧链终止法原理
Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA 的核苷酸序列。
双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger 等1977年提出。
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。
如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分四个泳道进行电泳。
以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA 复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。
当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。
ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影
5. 阅读测序结果
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA 单链DNA
加加 热入 ，引 退物 火，
带引物的模板单链DNA
链延伸---终止反应
EDTA
核素标记的dNTP
双 脱 氧 鸟 苷
分成四管 双 双 脱 脱 氧 氧 腺 胸 苷 苷
双 脱 氧 胞 苷
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 5℃加热 变性
冰上冷却 点样 开始电泳
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
Frederick Sanger
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基 ddNTP——双脱氧 核苷酸
基本原理：
DNA复制
ddNTP的结构
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶 底物：dNTP
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
放射自显影
固定凝胶 真空抽干 放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
模板：单链DNA 引物：需要
引物的作用：提供3’羟基 末端
双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分析
主要的blast程序
程序名 Blastn Blastp
查询序列 核酸
蛋白质
Blastx
核酸
Tblastn 蛋白质
TBlastx 核酸
数据库 核酸
蛋白质 蛋白质
核酸 核酸
搜索方法
核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列
蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的 序列
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白 质数据库中的序列逐一搜索。
高速自动DNA测序仪的结构及工作原理
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荧光化合物标记 链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表 颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。
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Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力： 手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约1200 bp。
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同理第二个反应产生的都是以C结 尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个 反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序 列了.
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假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以 产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果 是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可 以继续延伸, 产生GATCCGAT.
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2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。
其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。
DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。
通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。
ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。
在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。
在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。
通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。
二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。
1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。
双脱氧链终止法原理
双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法（又称Sanger法）是一种通过测序DNA分子中的核苷酸序列的方法。
它是由Frederick Sanger在1977年首次提出的，因此得名。
这种方法是通过测定DNA链的末端来确定其序列，是DNA测序的重要技术手段之一。
在双脱氧链终止法中，首先需要将待测DNA分子进行复制，得到一系列长度不同的DNA分子。
然后，将这些DNA分子与一种特殊的双脱氧核苷酸（ddNTP）一起进行反应。
这种特殊的ddNTP与普通的脱氧核苷酸（dNTP）相比，它在连接上缺少了一个3'羟基，因此无法再延长DNA链。
在反应过程中，当DNA链合成到ddNTP时，反应就会终止，形成一系列长度不同的DNA分子。
接下来，需要将这些终止的DNA分子进行分离和检测。
一般来说，可以通过凝胶电泳的方法将这些DNA分子按照长度进行分离。
然后，可以利用放射性同位素或荧光标记的探针来检测DNA分子的长度和序列。
通过测定不同长度的DNA分子，就可以确定原始DNA链的序列。
双脱氧链终止法的原理相对简单，但是在实际操作中需要高度的精确度和技术要求。
首先，需要保证DNA链的复制过程尽可能准确，避免出现错误的复制。
其次，需要保证ddNTP的浓度和反应条件的控制，以确保反应能够在正确的位置终止。
最后，需要对终止的DNA分子进行准确的分离和检测，以得到准确的测序结果。
双脱氧链终止法在DNA测序中具有重要的应用价值。
它可以用于测定DNA分子的序列，帮助科学家们研究基因的结构和功能，以及进行基因工程和遗传学研究。
同时，双脱氧链终止法也为医学诊断和药物研发提供了重要的技术手段。
总的来说，双脱氧链终止法是一种重要的DNA测序技术，通过对DNA分子进行复制、终止和检测，可以帮助科学家们准确地测定DNA分子的序列，为基因研究和医学应用提供重要的支持。
双脱氧末端终止法测序的原理
双脱氧末端终止法测序的原理双脱氧末端终止法测序，也称为Sanger测序法，是一种经典的DNA测序方法，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究中。
该方法的原理是利用DNA聚合酶在DNA合成过程中加入的一种特殊的二进制分子，即二进制脱氧核苷酸（dideoxynucleotide），来终止DNA链的延伸，从而得到一系列以不同二进制脱氧核苷酸为终止点的DNA片段。
通过测定这些DNA片段的长度和顺序，进而推导出原始DNA序列。
在双脱氧末端终止法测序中，首先需要将待测序列DNA分离成单链，并制备出一系列的DNA模板。
这些DNA模板中包含了待测序列DNA的不同长度的延伸片段，并且每个片段的延伸末端都是以一种特定的二进制脱氧核苷酸（ddNTP）为终止点。
这些ddNTP 与普通的脱氧核苷酸（dNTP）只有一个氧原子的差异，这个氧原子的缺失使得在DNA链的延伸过程中无法再连接新的核苷酸，从而终止了DNA链的生长。
接下来，将DNA模板与DNA聚合酶、DNA引物和dNTPs（包括普通的脱氧核苷酸和ddNTPs）一起放入反应体系中。
DNA聚合酶会根据DNA模板的序列，选择配对的dNTPs与DNA模板上的碱基进行连接，形成新的DNA链。
当DNA聚合酶遇到ddNTP时，由于ddNTP的特殊结构，无法与DNA模板上的碱基进行连接，因此DNA链的延伸被终止。
在反应结束后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，可以将不同长度的DNA片段分离开来。
然后，根据片段的大小顺序，可以推断出原始DNA序列。
由于每个终止点对应的ddNTP是特定的，因此可以通过识别终止点所对应的ddNTP，来确定原始DNA序列中相应位置的碱基。
双脱氧末端终止法测序具有一定的优势。
首先，该方法可以对较长的DNA片段进行测序，通常可以测序500至1000个碱基。
其次，该方法的准确性较高，错误率通常在1%以下。
此外，该方法操作简单，所需的设备和试剂相对较少，适用于大规模测序。
Sanger双脱氧链终止法
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Sanger双脱氧链终止法的具体操作：
测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分 别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸 (称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP), 然后进行 聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代 替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA 链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止 了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反 应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就 可以读出序列了.
带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP
（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）， ddNTP 。
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3
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所需模板及其获得方法：
单链DNA可以由双链DNA完全变性而得到。 其方法，简单的来说， 将反应体系加热至95℃即可得到。
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dATP与ddATP的区别：
dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用dNTP 来合成DNA 。 ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖2号3 号C上羟基的O被脱去，由于它掺入DNA后DNA 的合成就终止了，所以ddNTP是用来测序的。
Sanger双脱氧链终止法
——DNA测序的基本方法
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基本原理：
核苷酸的连接方式：磷酸二酯键
将2’ ，3’ –双脱氧 核苷酸（ddNTP） 参入到新合成的 DNA链中，由于参 入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与 下一位核苷酸反应 形成磷酸二酯键， DNA合成反应将中 止。
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2
通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，纯单链DNA模板，
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ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。
DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。
ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。
聚丙烯酰胺凝胶电泳特点
精度相当高！ 能分离长度达 300-500个碱基， 而差别仅一个 碱基的同系单 链核苷酸序列。
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
加加 热入 ，引 退物 火，
带引物的模板单链DNA
链延伸---终止反应
核素标记的dNTP
分成四管 双 双 双双 脱 脱 脱脱 氧 氧 氧氧 鸟 腺 胸胞 苷 苷 苷苷
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
Frederick Sanger
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
基本原理：
DNA复制
ddNTP的结构
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶 底物：dNTP 模板：单链DNA 引物：需要 引物的作用：提供3’羟基 末端
EDTA
乙二胺四乙酸，
一种二价金属
离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
聚丙烯酰胺凝胶电泳
95℃加热 变性
冰上冷却 点样
开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
Байду номын сангаас
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。