质粒与载体

质 质粒 粒与 与载 载体

体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员

一、质粒

绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。 原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。

二、质粒的类型

当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。这些分型标准之间并无横向关联。你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。

有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R­质 粒(R­plasmids)。有些质粒能在多种不同菌属细胞中生存，我们称它们为泛宿主性质粒 (broad­host­range plasmids)；有一些质粒只能在少数相关宿主中生存，我们称它们为狭宿主 性质粒(narrow­host­range plasmids)。具有结合生殖(conjugation)能力的质粒为结合质粒 (conjugative plasmids)；没有这种能力的质粒便是非结合质粒(non­conjugative plasmids)。其 它如侵袭性质粒(virulence plasmid)、 共生质粒(symbiotic plasmids)及巨型质粒(megaplasmids) 等等有关质粒性状叙述的名词不一而足。

三、质粒的复制

环状质粒的复制形式主要分 theta (θ)及 rolling circle 两种。基因体的复制都是由复制原开始。 原核性复制原约由 250 个碱基对组成，一般质粒的复制原常称为 oriV (origin of vegetative replication)；有时 R­质粒的复制原称为 oriR ；大肠杆菌的复制原称为 oriC 。Theta 形式的质 粒复制与细菌基因体复制一样，以 RNA 聚合脢(RNA polymerase)在复制原制造 RNA 引子 (RNA primer)，然后由 DNA 聚合脢(DNA polymerase)接手由此向两个方向分别复制 DNA ， 直到整个基因体复制完成。在复制过程中当然还有许多其它酵素的参与，这些酵素多由宿主 提供。有的质粒自己携带一些与复制有关的基因，这些基因多被命名为 rep ，如 repA 、repB

等等。Rolling circle 形式的质粒复制与部分噬菌体基因体的复制相似。环状双绞链中的一股 在复制原附近被酵素切开，然后环状股与线状股被分别复制完成。至于线状质粒的复制则是 靠特殊的 RNA引子或该质粒所具有的 telomere­like sequence。

四、质粒的套数与套数调控(copy number control)

在一个宿主细胞中某一特定质粒出现的个数称为套数(copy number)。在大肠杆菌中，质粒的 套数由 F­质粒(fertility plasmid)的一个到 pUCs 的数百个不等。质粒套数的控制与该质粒复 制的调控机制有关，几乎每一种质粒都有它独特之处。有关质粒套数的控制我们仅以两种代 表型机制来说明。

1. 反意 RNA(antisense RNA)：

ColE1 质粒的复制是由 RNA 聚合脢由其复制原(oriV)前方 555 个碱基对以前的启动子 (promoter)读出一段称为 RNA II的产物。这个称为前引子(preprimer)的 RNA II 会利用碱基 配对而自我折迭成可被 RNAase H(一种特殊的 RNA 水解脢)裁剪的立体结构。 RNA II经适当 的裁剪后就形成正确的复制引子，复制于焉开始。在 ColE1 质粒复制原前方 445个碱基对的

它与 RNA II 后方另有一个反向的启动子。 RNA聚合脢由此处转录出一条称为 RNA I的产物，

反向，刚好形成配对，这种 RNA称为反意 RNA(antisense RNA)。当 RNA I和 RNA II形成 RNA­RNA 杂合体(RNA­RNA hybrid)时，RNA II 无法形成可被 RNAase H剪裁的结构，复 制引子无法产生， 复制也不会有效地开始。 当然， 实际上还有许多辅助蛋白和酵素会控制 RNA I 和 RNA II之间的亲合力和 RNA I的水解速度。RNA I和 RNA II 的相对数量的增减决定了 ColE1 质粒的复制速度，也决定了该质粒的套数。

2. Iterons 与 repA：

质粒 pSC101的复制除了需要宿主供应的酵素外尚需要 RepA蛋白。RepA是 pSC101的基因 产物，在功能上他扮演了复制的活化因子(activator)与自我抑制因子(autorepressor)。RepA 基因位于 pSC101 复制原的前方，其转录方向和 pSC101 复制方向正好相反。在 RepA 基因 的启动子和 pSC101复制原中有好几个顺向和反向的重复 DNA 短段，长约 18~22 个碱基对， 称为 iteron(s)。RepA会粘黏在 iteron 上。质粒在低浓度(低套数)时，产生低浓度的 RepA促 进了质粒的复制；质粒在高浓度(高套数)时，产生大量的 RepA 粘黏在复制原和 RepA 基因 的启动子上抑制质粒的复制。于是，RepA和 iterons 的相互作用决定了 pSC101的套数。 五、质粒的不共容性(incompatibility)

有时我们会想知道一个细菌细胞中会同时出现多少种质粒呢(种类非个数，个数是指套数)？ 这个问题倒没有一个确切的答案。 由自然环境分离的细菌细胞中含有一至三种质粒是常见的， 有时多至七、八种也不令人意外。质粒的种类虽多，但并非所有的质粒都能同时在同一个宿 主细胞中生存。有一些质粒在同一个宿主细胞中会发生相互排斥的现象，我们称这种现象为 质粒的不共容性(incompatibility)。质粒的不共容与他们的复制机制与套数调控有关。当两种 复制与套数调控机制毫不相干的质粒在同一个细胞中生存时，它们各自复制再各自分配到不 同的子细胞中，不会发生干扰。当两种复制机制与套数调控相关或甚至相同的质粒在同一个 细胞中生存时，复制与套数调控机制就会把它们看做同一种质粒而将他们的套数控制在一定 的数目内。因为细胞分裂时质粒在子细胞中分配不均匀的缘故，经过几十次的细胞分裂后你 只可能在特定的子细胞中找到其中一种质粒。根据这种不共容性，质粒被分为许多不共容群