弥散性血管内凝血动物模型制作具体步骤及方法

弥散性血管内凝血动物模型制作具体步骤及方法

弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)是临床上一种获得性综合征，它可由各种不同的原因引发。临床上DIC主要表现为由微血管血栓形成和栓塞引起的多脏器功能障碍、出血、休克和微血管病性溶血性贫血。DIC代表了临床病理的一系列连续的严重表现，其主要特征是血管内凝血机制激活后，其局限性或代偿性控制进行性丧失。DIC的发生及发展机制十分复杂，许多影响因素至今仍未阐明。无论在何种原发病或何种因素诱导下发生DIC，机体凝血系统活化均既存在顺序性级联反应的特征，也存在正、负反馈使凝血反应放大或受到限制的特征。DIC时通常显示纤维蛋白分布在多种器官中，是导致器官功能衰竭的原因。抗凝治疗是阻断DIC病理过程的重要措施之一，其目的在于抑制广泛性微血栓形成的病理过程，防止血小板及各种凝血因子进一步消耗。为恢复其正常含量、重建正常的凝血与抗凝血平衡创造条件。因此，建立理想的DIC动物模型，用于实验研究非常重要。

1高分子右旋糖酐诱导大鼠弥散性血管内凝血模型

(1)复制方法体重为250～400g、10月龄雄性Wistar大鼠。按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉，大鼠仰卧固定于手术台上，颈部皮肤常规消毒与去毛。无菌手术暴露颈动脉、静脉，分别插管。用130g/L高分子右旋糖酐(分子量为480000)按15ml/kg体重的剂量经颈静脉注射，1min或3min注完。于给药*min 及给药后10、20、30min进行微循环观察，经显微电视录像观察回肠

下段肠系膜血管(包括一二级微动脉和一二级微静脉)流态以及微血流流态、血细胞聚集情况；给药后30min时，经模型大鼠颈动脉取血作相关凝血功能指标的检测，并进行血浆鱼精蛋白副凝试验(3R试验)；主要观察指标：模型大鼠微循环积分值、全血黏度、血浆黏度、相对黏度、血小板黏附率和聚集率、血小板计数、血浆凝血酶原时间、纤维蛋白原水平、裂体细胞检查。注射后30min麻醉处死大鼠，分别取其肺、肾、心等组织经10％甲醛溶液固定后，作常规组织切片，HE 染色，光镜下形态学观察。

(2)模型特点模型动物微血管流态变化突出，注射高分子右旋糖酐后流速变慢、血细胞淤滞、聚集、微血流呈粒缓流，出现严重的微循环障碍。用田牛氏微循环加权积分标准计算流态积分值，发现模型大鼠流态积分值明显高于实验前和正常对照动物，这些变化细动脉比细静脉更明显。造模后，模型动物血小板黏附率、聚集率明显增强，血小板计数显著减少，凝血酶原时间延长，纤维蛋白原降低，与正常动物相比有显著性差异；模型动物3R试验均为阳性。镜下病理组织学观察显示：模型大鼠可见纤维索性血栓和混合血栓，尤以肺内多见，其血涂片可见大量裂体细胞。本方法复制的大鼠DIC模型属于急性型，其特点为凝血因子的消耗性减少、继发纤溶系统的亢进、血液流变学和微循环的明显障碍。本模型制作方法简便，应用范围广，效果稳定。

(3)比较医学本模型的致病机制是当静脉注射高分子右旋糖酐后，模型大鼠微血流积分值升高，血流变慢；血液流动性的异常，导致了机体血管舒缩功能的紊乱，为DIC的发生创造了条件，此时无论血管收

缩、血流减少，还是血管舒张、血流淤滞，都不利于促凝物质和活化凝血因子从局部清除，而有利于纤黏蛋白(FN)在局部沉降。此外注射高分子右旋糖酐后模型动物的血黏度、血浆黏度、血小板黏附和聚集性均明显增强，导致机体血液动力学出现异常。由于血液动力学异常和血流阻力的变化密切相关，当血黏度增高时，血流阻力明显加大，其直接的结果就是造成微循环的明显障碍，导致组织细胞包括内皮细胞的损害，进而加重微循环障碍，如此恶性循环推动模型动物DIC的进展。本模型的疾病特征与临床患者的DIC类似，适用于DIC药物治疗和药物筛选方面的实验研究。

2脂多糖诱导兔弥散性血管内凝血模型

(1)复制方法体重2kg左右雄性新西兰兔，按30mg/kg体重的剂量经耳缘静脉注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉，麻醉后将兔仰卧固定于手术台上，颈部皮肤常规消毒与去毛。颈部正中无菌手术作一切口，钝性分离左侧颈总动脉，结扎动脉远心端，用18G静脉插管针穿刺并固定，以备留取标本用。按2.5mg/kg体重的剂量经兔耳缘静脉缓慢注入脂多糖(lipopolysaccharide)，分2次注射给药，间隔1h，每次脂多糖注射时间约为10min。注射脂多糖前及注射后2、4、6h分别采取兔血作活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原、血小板计数、抗凝血酶Ⅲ、血清纤维蛋白降解产物(FDP)检测。并于造模结束时麻醉处死动物，取心、肺、肾、脾与肝组织，用10％甲醛溶液固定，作常规组织切片，HE染色，光镜下观察。

(2)模型特点注射脂多糖后，模型兔活化部分凝血活酶时间明显延长，

血小板计数和纤维蛋白原显著降低，抗凝血酶Ⅲ活性明显下降，血清FDP无明显变化。镜下病理组织学观察显示，模型兔的心、肝、肺、肾、脾脏均可见微血栓形成，肺组织中尚有大量炎症细胞浸润。(3)比较医学 DIC是一种弥散而隐匿的血管内血液凝固现象，它可导致机体凝血因子不断消耗，临床上可造成患者广泛出血。本模型制作过程中，当注射脂多糖后兔的静脉穿刺部位有渗血，30min时动物出现呼吸频率明显增快、紫绀，血小板数量呈进行性降低，APTT明显延长；镜下病理组织学观察心、肺、肝、肾、脾组织内均有纤维蛋白血栓形成，证实静脉注射脂多糖可成功复制兔DIC模型。但模型动物血FDP无明显改变，表明脂多糖引起的DIC以消耗性凝血为主，纤溶活性改变不大；同时模型动物注射脂多糖后2、4、6h后APTT均显著延长，提示脂多糖诱发DIC过程中机体内源性凝血途径被启动，此时体内可通过外源性和内源性途径生成凝血酶，后者有广泛的促凝血和促血栓形成作用。本方法复制的DIC模型显示纤维蛋白分布在多种器官中，可导致模型动物发生多器官功能衰竭，模型DIC表现与临床上人类发生的DIC相似，可用于DIC发病机制及药物筛选方面的实验研究。