青霉素简介 杂蛋白去除
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• 发酵液中细微颗粒包括悬浮物和胶体颗粒，沉降困难。
预处理的条件
Leabharlann Baidu
发酵液
预处理
目的产物在胞外 目的产物在胞内
固液分离 细胞破碎
初步纯化
预处理的目的
• ⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度， 提高固液分离器的效率。
• ⑵尽可能使产物转入便于后处理的某一相中(多数是液相)。 • ⑶去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。
变性沉淀特点
• 使蛋白质溶解度变小，变性沉淀 • 使液体黏度降低，加快过滤速度 • 只适用于对热稳定的生化物质
3．盐析沉淀法
• 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降
盐析机理
• 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于 疏水区的相互作用导致沉淀 。
• 一般羧基电离度大于氨基，所以很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.0~5.5）
pH值对蛋白质荷电情况的影响
蛋白质的滴定曲线
• 不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点 （pI），当溶液（环境）pH值低于其pI时，蛋白质带正电荷，而 当环境pH值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越 多，其所带电荷越多.
发酵液成分
• 微生物发酵或动植物细胞培养结束后，发酵液(或培养液)中除
含有所需的生物活性物质外，还存在大量的菌体、细胞、胞内 外代谢产物及剩余的培养基成分等。
任务2.2 搜集预处理相关知识和资料
1
除蛋白质的方法
2
凝聚和絮凝
3
固液分离
4
膜分离
为什么要进行预处理？
• 发酵液中杂质很多，对后续分离影响最大的是高价无机离子 (Ca2+,Mg2+,Fe3+)和杂蛋白等。
导致胶体稳定性的原因
1、动力学稳定性：无规则布朗运动强，对抗重力影 响的能力强。
2、聚集稳定性： （1）胶体带电相斥（憎水性胶体） （2）胶体表面水化膜（亲水性胶体）
方法选择的目的
• 破坏双电层结构 • 破坏水化膜
因合并而沉降
1. 等电点沉淀法
• 等电点（PI）：蛋白质为两性物质，在酸性溶液中带正电荷，碱性溶液中带负 电荷，而在某一PH值下，净电荷为零，称为等电点。此时在水中溶解度最小， 能沉淀除去。
成品包装
发酵阶段 提取阶段
发酵培养控制
➢ 加糖控制。残糖降至0.6%，pH上升时加糖 ➢ 补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发酵液氨氮量控制在
0.01%~0.05%。前体：发酵液中残存乙酰胺浓度为0.05%~0.08%。 ➢ pH控制。6.6~6.4 ➢ 温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。 ➢ 溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。 ➢ 泡沫的控制。
以考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。
变性沉淀方法
• 加热：利用蛋白质等生物大分子对热的稳定性不同，加热破坏某些组分， 而保存另一些组分 。
• 加入化学试剂 ：金属盐、表面活性剂、某些有机酸、酚、卤代烷等可使 混合液中的蛋白质或部分蛋白质发生变性而沉淀。
• 调节pH值：当溶液的酸碱性发生剧烈变化时，可引起蛋白质的变性而 沉淀。
一、沉淀常用的几种方法
• 等电点法
• 变性沉淀法 • 盐析
去除蛋白质
• 有机溶剂沉淀法
• 反应沉淀法（去除蛋白质和无机金属离子）
首先了解蛋白质
蛋白质一级结构
• 肽或蛋白质的氨基酸序列（或残基序列）
蛋白质二级结构
• 依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为α 螺旋和β折叠。
1. 等电点沉淀法
• 沉淀方法：加酸 • 常用酸化剂：硫酸、盐酸、磷酸、草酸等
等电点沉淀法的特点
• 不同的蛋白质，具有不同的等电点 • 同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同 • 避免直接用强酸强碱调节PH，引起目的药物成分蛋白或酶的变性 • 各种蛋白质在等电点时，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全 ，可
• 盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合，形成离子 对，即盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的 电排斥作用减弱而相互靠拢、聚集形成沉淀。
常用的盐析剂
• 硫酸铵：溶解度大（767g/L） • 硫酸钠 • 磷酸盐 • 柠檬酸盐
盐析的影响因素
• 盐析剂的性质和加入量
（1）符合盐析分布曲线 （2）一般阴离子的盐析效果比阳离子好 。对 于阴离子，带电荷较多者，盐析能力较强，对 于阳离子，带电荷较多者，盐析能力较低。
培养基
➢ 碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 ➢ 氮源：玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及
氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。 ➢ 前体：如苯乙酸或苯乙酰胺。 ➢ 无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。
抗生素制备的一般流程图
菌种
孢子制备
种子制备
前体
发酵
发酵液预处理及种子加滤
提取及精制
成品检验
杂蛋白的去除
主讲教师
任务2.1 认识青霉素发酵液
青霉素简介
青霉素的化学结构
青霉素是含有青霉素母核的多种化合物的总称，青霉素发酵液中 至少含有5种以上的不同的青霉素：青霉素G、青霉素F、青霉素X、 青霉素K及二氢青霉素F等。
青霉素分子结构球棍模型
青霉素生产发酵工艺
菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌 和球状菌两种，根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和 绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉素。
蛋白质三级结构
• 通过多个二级结构元素在三维空间的排 列所形成的一个蛋白质分子的三维结构 。
蛋白质四级结构
• 由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子 。
• 在水中近似为球形 • “亲水表面，疏水内核” • 水中为胶体，稳定 • 有水化膜和双电层
悬浮物的存在状态
• 发酵液悬浮物在液体中以胶体形式存在。都带有电荷，且电性相同， 其组成的溶液是胶体溶液。
预处理方法的选择
• 药物自身理化性质 • 药物稳定性 • 药物分子量 • 药物的活性
预处理的方法
• 沉淀 • 凝聚和絮凝
什么是沉淀？
定义：利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质 在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的 过程。 发酵液沉淀主要去除的是杂蛋白。
沉淀法的特点
• 操作简单、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而 言，分离度不高、选择性不强
预处理的条件
Leabharlann Baidu
发酵液
预处理
目的产物在胞外 目的产物在胞内
固液分离 细胞破碎
初步纯化
预处理的目的
• ⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度， 提高固液分离器的效率。
• ⑵尽可能使产物转入便于后处理的某一相中(多数是液相)。 • ⑶去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。
变性沉淀特点
• 使蛋白质溶解度变小，变性沉淀 • 使液体黏度降低，加快过滤速度 • 只适用于对热稳定的生化物质
3．盐析沉淀法
• 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降
盐析机理
• 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于 疏水区的相互作用导致沉淀 。
• 一般羧基电离度大于氨基，所以很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.0~5.5）
pH值对蛋白质荷电情况的影响
蛋白质的滴定曲线
• 不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点 （pI），当溶液（环境）pH值低于其pI时，蛋白质带正电荷，而 当环境pH值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越 多，其所带电荷越多.
发酵液成分
• 微生物发酵或动植物细胞培养结束后，发酵液(或培养液)中除
含有所需的生物活性物质外，还存在大量的菌体、细胞、胞内 外代谢产物及剩余的培养基成分等。
任务2.2 搜集预处理相关知识和资料
1
除蛋白质的方法
2
凝聚和絮凝
3
固液分离
4
膜分离
为什么要进行预处理？
• 发酵液中杂质很多，对后续分离影响最大的是高价无机离子 (Ca2+,Mg2+,Fe3+)和杂蛋白等。
导致胶体稳定性的原因
1、动力学稳定性：无规则布朗运动强，对抗重力影 响的能力强。
2、聚集稳定性： （1）胶体带电相斥（憎水性胶体） （2）胶体表面水化膜（亲水性胶体）
方法选择的目的
• 破坏双电层结构 • 破坏水化膜
因合并而沉降
1. 等电点沉淀法
• 等电点（PI）：蛋白质为两性物质，在酸性溶液中带正电荷，碱性溶液中带负 电荷，而在某一PH值下，净电荷为零，称为等电点。此时在水中溶解度最小， 能沉淀除去。
成品包装
发酵阶段 提取阶段
发酵培养控制
➢ 加糖控制。残糖降至0.6%，pH上升时加糖 ➢ 补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发酵液氨氮量控制在
0.01%~0.05%。前体：发酵液中残存乙酰胺浓度为0.05%~0.08%。 ➢ pH控制。6.6~6.4 ➢ 温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。 ➢ 溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。 ➢ 泡沫的控制。
以考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。
变性沉淀方法
• 加热：利用蛋白质等生物大分子对热的稳定性不同，加热破坏某些组分， 而保存另一些组分 。
• 加入化学试剂 ：金属盐、表面活性剂、某些有机酸、酚、卤代烷等可使 混合液中的蛋白质或部分蛋白质发生变性而沉淀。
• 调节pH值：当溶液的酸碱性发生剧烈变化时，可引起蛋白质的变性而 沉淀。
一、沉淀常用的几种方法
• 等电点法
• 变性沉淀法 • 盐析
去除蛋白质
• 有机溶剂沉淀法
• 反应沉淀法（去除蛋白质和无机金属离子）
首先了解蛋白质
蛋白质一级结构
• 肽或蛋白质的氨基酸序列（或残基序列）
蛋白质二级结构
• 依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为α 螺旋和β折叠。
1. 等电点沉淀法
• 沉淀方法：加酸 • 常用酸化剂：硫酸、盐酸、磷酸、草酸等
等电点沉淀法的特点
• 不同的蛋白质，具有不同的等电点 • 同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同 • 避免直接用强酸强碱调节PH，引起目的药物成分蛋白或酶的变性 • 各种蛋白质在等电点时，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全 ，可
• 盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合，形成离子 对，即盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的 电排斥作用减弱而相互靠拢、聚集形成沉淀。
常用的盐析剂
• 硫酸铵：溶解度大（767g/L） • 硫酸钠 • 磷酸盐 • 柠檬酸盐
盐析的影响因素
• 盐析剂的性质和加入量
（1）符合盐析分布曲线 （2）一般阴离子的盐析效果比阳离子好 。对 于阴离子，带电荷较多者，盐析能力较强，对 于阳离子，带电荷较多者，盐析能力较低。
培养基
➢ 碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 ➢ 氮源：玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及
氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。 ➢ 前体：如苯乙酸或苯乙酰胺。 ➢ 无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。
抗生素制备的一般流程图
菌种
孢子制备
种子制备
前体
发酵
发酵液预处理及种子加滤
提取及精制
成品检验
杂蛋白的去除
主讲教师
任务2.1 认识青霉素发酵液
青霉素简介
青霉素的化学结构
青霉素是含有青霉素母核的多种化合物的总称，青霉素发酵液中 至少含有5种以上的不同的青霉素：青霉素G、青霉素F、青霉素X、 青霉素K及二氢青霉素F等。
青霉素分子结构球棍模型
青霉素生产发酵工艺
菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌 和球状菌两种，根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和 绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉素。
蛋白质三级结构
• 通过多个二级结构元素在三维空间的排 列所形成的一个蛋白质分子的三维结构 。
蛋白质四级结构
• 由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子 。
• 在水中近似为球形 • “亲水表面，疏水内核” • 水中为胶体，稳定 • 有水化膜和双电层
悬浮物的存在状态
• 发酵液悬浮物在液体中以胶体形式存在。都带有电荷，且电性相同， 其组成的溶液是胶体溶液。
预处理方法的选择
• 药物自身理化性质 • 药物稳定性 • 药物分子量 • 药物的活性
预处理的方法
• 沉淀 • 凝聚和絮凝
什么是沉淀？
定义：利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质 在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的 过程。 发酵液沉淀主要去除的是杂蛋白。
沉淀法的特点
• 操作简单、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而 言，分离度不高、选择性不强