常见核酸染料选择浅析

常见核酸染料选择浅析
（李路军河南农业职业学院植物科学系河南郑州450000）
摘要：由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。

DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料。

除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂。

下面比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。

关键词：核酸染料、EB、GeneFinder、Goldview、SYBER greenI、GelRed、GelGreen
引言：
作为生物体内的重要的大分子，核酸是研究生命现象与本质的物质基础，通过对它们的理化性质、复制与转录、表达与调控等的研究，可以了解生命有关的本质规律。

因此，对核酸的研究具有及其重要的意义。

但核酸肉眼不可见，对其的研究主要是借助一定的仪器来观察它的形态、大小、表达量，其中最常见的也是最简单的是琼脂糖凝胶电泳。

EB(溴化乙锭)是实验室最常用的核酸染料，有着简单、快速、灵敏度高的特点，但是由于其有着强烈的致突变能力和中度致癌性，对实验者和周围环境都有着较大的危害。

溴化乙锭(EB)是分子生物学实验室常用的一种核酸荧光染料。

但是，由于EB是一种强烈的致癌物，因此，如何消除EB对实验室的污染，是分子生物学实验室安全所必须面对的一个难题。

A bstract：Because only needs the simple temperate physical method(illumination)to stimulate and the examination,the fluorescent dye studies the biology microcosm is when specially the nucleic acid one of most commonly used tracing tools.After DNA electrophoresis,examines the gelatin E
B is the fluorescence nucleic acid dye which probably the most person knew very well. Except dyes the rubber,the fluorescence nucleic acid dye may also use in the fluorescence home position hybrid taking the common counterstain.Following compares in the molecular biology experiment and the cytology experiment the commonly used fluorescent dye.
Key word:Nucleic acid dye,EB,GeneFinder,Goldview,SYBER greenI,GelRed,GelGreen
Introduction：In the achievement organism's important macro-molecule,the nucleic acid is studies the biological phenomena and the essential material base,through to their physics and chemistry nature,the duplication and the duplication,the expression and the regulation and so on research,may understand the life related essence rule.Therefore,has and the vital significance to the nucleic acid research.But the nucleic acid naked eye is not obvious,is mainly draws support from certain instrument to its research to observe its shape,the size,the expression quantity,what most common is also the simple is the agarose gel electrophoresis.EB(bromination second grade spindle)is the laboratory most commonly used nucleic acid dye,has simply,fast,the sensitivity high characteristic,but because it has intense sends the sudden change ability and the moderate
carcinogenicity,has the big harm to the laboratory technician and the environment.Bromination second grade spindle(EB)is the molecular biology laboratory commonly used one kind of nucleic acid fluorescent dye.But,because EB is one kind of intense careinogen,therefore,how to eliminate EB to the laboratory pollution,is a difficult problem which the molecular biology laboratory security must face.
1.EB核酸染料
溴化乙锭（EB）是一种常规核酸染料，被广泛应用于观察、检测琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中的DNA或RNA。

但EB是一种强诱变剂，并有中等毒性[1]，对人体有潜在危害性。

废弃的EB染液易污染环境，必须进行净化处理[3]。

EB本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。

EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。

前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。

EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。

另外，EB被广泛用于观察、检测琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中的DNA／RNA。

其含有一个可以嵌人DNA堆积碱基之间的一个三环平面基，它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。

在高离子强度的饱和溶液中，大约每2．5个碱基插人一个溴化乙锭分子。

当染料分子插人后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。

这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并在紫外线激发下呈现红色荧光，其荧光产率比游离染料有所增加[4]。

EB可反复使用、重复性高，在平时实验中发现EB胶反复凝融4次染色效果还能得到保证。

在电泳实验或其他核酸分离实验中，常用EB作非放射性的Marker，来识别和显示核酸条带。

尽管EB是一种高效的显色剂，但它的高危险性要求特殊的安全管理和回收流程。

EB可以通过皮肤吸收，因此应当避免一切与EB的直接接触。

另外，EB对皮肤，眼睛，口腔和上呼吸道系统有刺激性作用。

应将EB安全密封，并密闭存放于干燥避光处。

但其有一个致命的缺点就是可诱发突变，具有潜在致癌性，且具有中等毒性，可能对操作人员造成危害和对环境造成污染[7]．因此实验结束后，应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。

1.1.EB核酸染料的特点：
1.安全性：溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。

EB是强诱变剂，具有高致癌性
2.灵敏度：可以检测出l~10ng的样本
3.适用范围：凝胶中有游离的EB（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带
2.GeneFinder核酸染料
GeneFinder™是新型核酸染料，具有安全、灵敏等突出优点，可以代替溴化乙锭(EB)作为各种核酸电泳的染色剂。

与强致癌性的EB不同，GeneFinder™属于花青类染料，毒性很低，使用安全,可有效保护实验操作者和环境。

GeneFinder™与dsDNA结合荧光信号可增强800—1000倍，其检测核酸的灵敏度比EB染色法平均高10倍左右，与美国Molecular Probe 公司的SYBR Green I染料的灵敏度相当。

GeneFinder™染料最大吸收峰为470nm，与该染料结合的核酸在紫外线下呈现绿色荧光，另外，该染料同样能引起有机体突变，在使用时候一样要采取适当的保护措施。

溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。

溴化乙锭是强诱变剂，
具有强致癌性！GeneFinder™、SYBR Safe和溴化乙锭（EB）Ames测试结果显示EB容易引起有机体突变，如下图。

灵敏度平均高于EB法10倍左右。

2.1.GeneFinder的特点：
1.安全性：GeneFinder核酸染料为花青类染料，其致突变性远低于EB数倍甚至数十倍
2.灵敏度：检测核酸的灵敏度平均高于EB染色法10倍左右
3.操作简单：本染料有多种使用方法，操作简单
4.适用范围：适用于多种核酸电泳分析，可以对DNA、RNA、及寡核苷酸等进行染色
5.兼容性：对常用酶（如Taq酶、逆转录酶、内切酶、连接酶等）没有抑制作用
3.Goldview核酸染料
GoldenView™是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA 时，GoldenView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。

在100ml琼脂糖胶溶液中加入5-10µl GoldenView™即可。

在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭EB是一种强致癌剂，选用GoldenView™代替EB比较明智和安全。

目前尚未发现Geneview有致癌性，但是在使用中发现它有一定的刺激性，在使用过程中应戴上手套[8]。

Goldview对于大片段DNA的染色效果还凑合，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好，还有一个很致命的弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。

所以应该抓紧时间拍照后再观察。

另外Goldview不适用于胶回收。

灵敏度差，本底色严重，不利于回收，不稳定。

毒性很大，尤其在紫外灯下其诱导突变能力极高。

3.1.Goldview核酸染料的特点：
1.安全性：未发现GoldView™有致癌作用
2.灵敏度：灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用
3.适用范围：用于琼脂糖电泳检测DNA或RNA的染色
4.SYBER greenI核酸染料
SYBER greenI是一种经济的核酸染料，它与双链DNA(dsDNA)结合后，荧光大大增强，检测灵敏度高于EB。

在紫外照射透视下，与双链DNA接合的SYBR GreenI呈现绿色荧光，
但稳定性较差(怕光、怕水、怕热)，使得染色的重复性较低。

它对于<50bp DNA片段染色能力的缺失及其对<l00bpDNA片段的低灵敏度是其常规使用的最大障碍[7]。

这种致畸性低而相对安全得多的核酸染料在标准300nm的紫外透射光下，能检测低至60pg的dsDNA，比EB至少高了一个数量级。

同时，SYBR Green I染料-DNA复合物的荧光量子产率约为0.8，相当于EB的5倍。

SYBR Green I的使用和EB同样简单，而具有比EB更高的灵敏度，致变性也低得多，甚至几乎没有毒性。

SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单，无须脱色或冲洗；至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25～100倍。

SYBR Green I与dsDNA结合荧光信号会增强800～1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低，可适用于多种电泳分析。

SYBR Green I与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对分子生物学中常用的酶（如：Taq酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用；另外，SYBR Green I与EB相比，诱变能力大大降低。

SYBR GreenI是几年前推出的一种高灵敏度[5]且不具有强致突变性[6]的核酸染料，但由于其高昂的价格限制了它的广泛使用。

4.1.SYBR Green I核酸染料特点：
1.灵敏度：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25～100倍
2.信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低
3.操作简单：无须脱色或冲洗
4.适用范围：可适用于多种电泳分析
5.方便性：不影响其它修饰酶作用
6.经济性：价格比银染便宜
比较图1图3和图2图4的结果，用前染法染色琼脂糖凝胶电泳中不同浓度，不同大小的DNA片段时，都能显示出10ng以下的DNA条带,说明2种染料都可用于前染法。

但从图2和图4中可看出，将SYBR Green I加入凝胶中有可能造成DNA条带的扭曲，使泳带不整齐。

这可能是由于染料SYBR Green I嵌入了DNA碱基中，局部改变了DNA的大小或构型，从而影响到其迁移情况。

图5和图6的结果比较表明，用后染法染色的DNA条带比较清晰。

尤其是SYBR Green I的染色效果与前染法相比其条带更清晰DNA分离效果更好，没有条带扭曲的现象。

另外，电泳电压对DNA的分离效果也有影响，电压偏高，有可能导致分离效果不理想。

2种染料的前染和后染结果表明，2种染色方法都能满足一般实验观察的需要。

对于传统染料EB前染和后染效果相当，这与朱春江报道的结果一致[2]。

但比较图2、图4与图6可以看出，对于新型染料SYBR Green I，2种染色方法染色后背景均比EB清晰。

但要想取得较理想的结果，则用后染法染色比较好，DNA条带清楚，灵敏度高。

我们还用SYBR Green I后染法对NRH产物进行了染色观察，其染色DNA条带清晰，表明该染料可用于PCR产物的检测。

2种染料的染色结果表明SYBR Green I也是一种操作简单，染色效果理想的核酸染料，可替代强致突变性染料EB用于常规凝胶电泳中DNA的染色，从而减少由于大量使用对人体的危害和对环境的污染,这与Bourzac等的研究结果一致。

但实验过程中也发现SYBR Green I的稳定性尚不如EB需要避光低温保存，且反复冻融，重复使用时效果变差。

尽管EB有强致癌性，但仍是目前使用较多的核酸染料，其中部分原因就是因为新推出的核酸染料虽然具有相当好的染色效果，但存在稳定性差、价格昂贵等缺点。

5.GelRed和GelGreen核酸染料
GelRed和GelGreen是集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。

其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。

目前大多数商业化的核酸染料（凝胶染色试剂）总是在安全性、稳定性和灵敏性等方面不完全令人满意。

例如，虽然EB(溴化乙啶）作为目前使用最广泛的核酸凝胶染色试剂，能够在多数应用中提供可以接受的灵敏度，但它是一种高诱变性的化学物质。

而且EB 染色后具有较高的背景荧光信号（如图1），而GelRed染色后具有较低的背景荧光信号（如图2）。

GelRed和GelGreen无论用于预制凝胶染色还是凝胶电泳后染色，都表现出了极高的灵敏度。

为配合312nm UV凝胶成像系统而设计的GelRed，在使用了我们新开发的具有专利的试验步骤后（该试验步骤中使用稀释的NaCl溶液替代传统的TBE缓冲溶液），在凝胶电泳后染色中优于或者至少相当于SYBR Gold。

但与SYBR Gold不同，GelRed在预制凝胶中使用时仍然有极高的灵敏度，事实上GelRed在检测低浓度、微量DNA方面比EB表现出更高的灵敏度[10]，尤其对小分子量的DNA检测非常灵敏（图1）。

GelGreen可以满足使用488nm激光凝胶扫描仪或者可见光激发的Dark Reader的研究人员的使用要。

GelGreen无论是在预制凝胶还是凝胶电泳后染色中都与SYBR Green I灵敏度相当，但不存在后者的不稳定性问题。

实际上，GelRed和GelGreen，特别是GelRed非常稳定，可以长期在室温下保存。

当这两种染料稀释在TBE或者类似的电泳缓冲溶液中时甚至可以使用微波炉加热，便于采用常规方法制备预制凝胶。

含有染料的预制凝胶可以成批制备，长期保存。

GelRed和GelGreen相比EB或SYBR Green I提高了安全性。

独立的测试服务公司进行的标准艾姆斯氏测试结果表明，在18.5μg/mL（该浓度远高于推荐用于电泳后染色的约4μg/mL的3X染色液）浓度下，GelGreen没有诱变性，而GelRed也仅在S9代谢活化时有微弱的诱变性。

GelRed和GelGreen的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。

相反，SYBR Green I广泛地用于活细胞线粒体和核DNA染色，这正是由于它能快速的被细胞吞入[9]。

由于已知SYBR Green I 对紫外线导致的突变有强烈的增强作用，因此它的高细胞膜透性使它在紫外环境观察时成为凝胶染色的主要有害物质。

5.1.GelRed和GelGreen核酸染料特点：
1.安全性：无毒，诱变性远远小于EB。

2.灵敏度：适用于各种大小片段的电泳染色，对核酸迁移的影响小于SYBR Green I。

3.稳定性：适用于加热方法制备琼脂糖凝胶；室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定，耐光性强。

4.信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。

5.操作简单：与EB一样，可直接用紫外凝胶透射仪观察。

6.适用范围：可选择电泳前染色（胶染法）或电泳后染色（泡染法）；适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳；可用于dsDNA或ssDNA或RNA染色。

总结：
核酸染色是核酸研究的重要组成部分，溴化乙锭（EB）是核酸研究中常用的染料，因其自身存在的缺点，目前研究者正不断推出新的核酸染料，这些新型核酸染料可以代替EB广泛使用，从而减少大量使用EB对人体的危害和对环境的污染，使用者可以根据自己的需要选择适合的染料。

参考文献：
[1].萨噼审鲁克J．弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T分子克隆实验指南[M]第一版北京：科学出版社．I995．304—315．
[2].朱春江、刘敬忠。

在改进EB作为核酸染色剂中的发现[J]华夏医学2000,13(4):536
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[4].SingerVL，LawlorTE，Yue S．Comparison of SYBRGreenI nucleicacid gel stain mutagenicity an d ethidium bromide mutagenicity in theSalmonella／mammalian nficmsome reverse mutation assay(Ames test)[J]．Mutat Res，2002，439(1)：37—47．
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[9].王俊玲，李明，田景花，等．河北农业大学学报，2004，27(3)：29～32．
[10].Fan H，Cook JA．Molecular Mechanisms of Endotoxin Tolerance[J]．EndotoxinRes，2OO4，10(2)：7l一84、。