噬菌体载体
λ噬菌体载体名词解释
λ噬菌体载体是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的载体，用于将外源DNA序列引入细菌细胞中。
噬菌体是一种寄生性病毒，可以感染细菌并在其内部复制。
而λ噬菌体是其中最为常见和常用的一种。
λ噬菌体载体通常由数万个碱基对的环状DNA组成，其中包含了多个重要的功能区域。
其中，最重要的功能区域是Origins of Replication（ORI），即复制起始点，负责引导DNA的复制。
此外，载体还包含了选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以便在细菌培养基中筛选带有该载体的细菌。
λ噬菌体载体还含有多个限制内切酶切位点，这些切位点可以用于将外源DNA序列插入到载体的特定位置上。
通过将外源DNA与载体进行限制性内切酶切割，然后使用DNA连接酶进行连接，可以将外源DNA序列插入到载体的DNA链上。
这一过程称为重组。
一旦重组完成，λ噬菌体载体可以通过转化的方式引入到宿主细菌中。
转化是指将外源DNA 导入到细菌细胞中的过程。
一旦载体进入到细菌细胞中，它会在细菌细胞内部复制，并产生大量的噬菌体颗粒。
这些噬菌体颗粒可以感染其他细菌细胞，并将携带的外源DNA序列传递给它们。
λ噬菌体载体在分子生物学和基因工程研究中具有广泛的应用。
它可以用于构建基因文库，即将外源DNA序列插入到载体上，并通过转化的方式导入到细菌细胞中。
这样，研究人员就可以通过筛选和分析细菌细胞中的载体来获得感兴趣的外源DNA序列。
此外，λ噬菌体载体还可以用于基因表达，即将外源DNA序列插入到载体的表达位点上，以便在细菌细胞中大量产生特定的蛋白质。
总之，λ噬菌体载体是一种在分子生物学和基因工程领域中被广泛使用的载体。
它具有多个重要的功能区域，可以用于将外源DNA序列引入到细菌细胞中，并在其中进行复制和表达。
通过利用λ噬菌体载体，研究人员可以进行基因库构建、基因表达和其他相关研究，为生物技术的发展提供了重要的工具和平台。
第一章1-6噬菌体载体2
3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。
•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。
第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。
•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。
用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。
•该载体克隆效率很高。
•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。
•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。
Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。
筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。
反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。
•核酸探针杂交。
Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
噬菌体载体的应用原理
噬菌体载体的应用原理1. 背景介绍噬菌体（Phage）作为一类侵染细菌的病毒，不仅是微生物学研究的重要对象，还被广泛应用于分子生物学研究和基因工程领域。
噬菌体载体（Phage vector）则是指将噬菌体进行基因改造，使其能够携带外源基因，并在细菌中进行复制和表达的工具。
噬菌体载体具有高度稳定性、高效载带能力以及可控的基因表达特点，因此在基因工程、基因治疗等领域得到了广泛应用。
2. 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建主要包括以下几个步骤：2.1 基因插入首先，需要选择合适的噬菌体作为载体，并在其基因组中选择一个合适的位点进行基因插入。
一般而言，选择的位点应该具有低于正常表达基因的水平，以避免影响载体的稳定性和复制效率。
将目标基因构建为重组DNA片段，并将其连接到载体DNA的适当位点上，通常使用酶切和连接技术。
2.2 载体包装插入目标基因之后，需要将噬菌体载体进行包装，以使其能够感染目标细菌并进行复制。
噬菌体包装一般通过混合目标基因与噬菌体DNA前体，然后加入相应的包装酶，通过体外反应来完成。
这样一来，就可以得到包含目标基因的噬菌体颗粒。
3. 噬菌体载体的应用噬菌体载体的应用可分为以下几个方面：3.1 基因工程研究噬菌体载体在基因工程研究中被广泛用于基因克隆、基因转染和基因表达等方面。
通过将目标基因插入噬菌体载体中，并利用噬菌体的感染和复制能力，可以高效地将外源基因导入到细菌中，并进行大规模扩增和表达。
此外，噬菌体载体还可以用于构建和筛选基因文库，以便进行基因功能的研究和探索。
3.2 基因治疗噬菌体载体作为基因传递工具，被广泛应用于基因治疗领域。
通过将治疗相关基因插入噬菌体载体中，可以使其能够有效地传递到患者的细胞中，并在细胞内进行表达，以达到治疗的目的。
噬菌体载体具有较高的基因载载能力和感染效率，这使得其成为一种理想的基因传递工具，对于遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗具有重要意义。
3.3 基因筛选与定向进化噬菌体载体被广泛用于基因筛选和定向进化等研究领域。
噬菌体
包装容量
• λ噬菌体载体可插入长 噬菌体载体可插入长5-20kb的外来 的外来DNA，这 噬菌体载体可插入长 的外来 ， 比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装 长得多； 比质粒载体能插入的 长得多 的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建 效率高得比质粒载体复杂。 • 理论上的极限值可达 理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有 ， 效的克隆范围仅为15kb左右 效的克隆范围仅为 左右
（3）外源片断与载体的连接 ） • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 联体，以利于将两个cos位点之间的片断 联体，以利于将两个 位点之间的片断 装入噬菌体颗粒
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染 ）重组噬菌体的体外包装， 力的噬菌体颗粒 • 利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白 利用特殊材料， • 连接产物与包装蛋白混合时，就可完成 连接产物与包装蛋白混合时， 包装反应， 包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒 • 包装蛋白对所包装的 包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选 大小有高度选 择性， 范围： 分子的75％－ ％ 择性， 范围：λDNA分子的 ％－ 分子的 ％－105％
基因克隆载体 (λ噬菌体载体 噬菌体载体) 噬菌体载体
• 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形， 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头 部和尾部两部分组成。 部和尾部两部分组成。 • 头部 核心：核酸（ 核心：核酸（DNA或RNA） 或 ） 衣壳：蛋白质， 衣壳：蛋白质，六边形立体对称 • 尾部 蛋白质 尾部( 蛋白质) 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、尾刺 与吸附宿主有关
基因工程4-2 (简要) 基因工程的载体
其中 BamH I 切点还可以连接经 Sau 3A 或 Mbo I部分消化的DNA片段，虽然在克隆过程 中载体上的 BamH I 位点被破坏了，但可以选 用EcoR I或Sal I作消化作用，便能回收到克隆 的外源DNA片段。
* 溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌。 （即含有原噬菌体的寄主细胞）
* 原噬菌体 (prophage) ：在溶源性细菌内存在的整合或非 整合的噬菌体DNA（所谓整合是指噬菌体DNA已插入到 寄主细胞染色体DNA之中）。 溶源性细菌具有免疫性，能够不再受同种噬菌体的 侵染，这一现象称为超感染免疫性。
2. EMBL系列载体 是 一类 替 换型载 体，适 用于克 隆长度 为 8~23 的可取代区段的两 侧，各有一段切点相同、方向相反的多克隆位 点，能够被EcoR I、BamH I和Sal I所识别，因 而可用来克隆由这三类限制酶所产生的任何一 种限制片段。
DNA的复制在早期是按形式从双向进行 的，由一个环状分子复制成两个环状分子。若
进入裂解途径的晚期，则进行滚环复制，由一
个环状DNA分子复制成多个 DNA分子连在一
起的线状长多连体分子。
在噬菌体包装时， DNA的多连体分子经过
核酸酶的切割作用，从cos位点处将它分离成单
位长度的单体分子之后，才能够被包装起来。
3. DNA的包装限制问题： 噬菌体的包装能力，控制在野生型 DNA 长度的 75~105% 。在这个范围内的 DNA 可以被 包装成有活性的噬菌体颗粒，而超出这个范围 的就不能形成正常大小的噬菌斑。
用噬菌体作载体时，对外源DNA片段的大 小有比较严格的要求。若按野生型 DNA 分子 长度为48 kb计算，其包装上限为51 kb；由于野 生型的 DNA基因组中必要基因的DNA区段占 28 kb ，所以 载体克隆外源 DNA 片段的理论极 限值是23 kb。一般的载体的包装容量在15 kb 左右。
噬菌体作为载体的使用流程
噬菌体作为载体的使用流程1. 简介噬菌体是一种可以感染细菌的病毒，它可以被利用作为生物学研究和生物工程领域的载体。
在使用噬菌体作为载体时，有一系列的流程需要遵循以确保实验的成功进行。
本文将介绍噬菌体作为载体的使用流程。
2. 噬菌体的培养和扩增在使用噬菌体作为载体之前，首先需要培养和扩增噬菌体。
以下是噬菌体的培养和扩增流程：•准备培养基：根据实验需求，选择适合噬菌体生长的培养基，并准备好所需的培养基。
•制备噬菌体接种物：选择适当的宿主细菌，如大肠杆菌等，并将其在培养基中进行培养，直至细菌达到适当的生长状态。
•加入噬菌体：将培养好的噬菌体加入到宿主细菌培养物中，使其与细菌发生感染。
•培养噬菌体：将噬菌体和宿主细菌混合物在恰当的条件下进行培养，如温度、pH等。
•扩增噬菌体：通过适当的培养时间和培养条件，使噬菌体扩增至所需的数量。
3. 分离和纯化噬菌体在培养和扩增噬菌体后，需要对其进行分离和纯化，以获得纯净的噬菌体溶液。
以下是噬菌体的分离和纯化流程：•离心分离：将培养物进行离心，以分离噬菌体颗粒和残留的细菌细胞。
•滤过分离：通过使用合适的孔径滤膜，将噬菌体溶液进行滤过分离，去除杂质。
•超速离心：利用超速离心技术进一步分离噬菌体颗粒和溶液中的其他组分。
•超滤：通过使用适当的分子量切割膜，将噬菌体颗粒从溶液中分离出来。
•冻干与储存：将纯化的噬菌体溶液进行冻干处理，并储存于适当的条件下。
4. DNA插入纯化的噬菌体作为载体可以用于DNA插入。
以下是噬菌体的DNA插入流程：•DNA准备：从源中提取目标DNA，并进行适当的处理，如限制性酶切。
•DNA连接：将目标DNA与噬菌体载体DNA进行连接，通过适当的连接酶进行连接。
•转化：将连接好的DNA转化到适当的宿主细菌中，使其得到插入噬菌体的DNA。
•选择与筛选：通过选择性培养基或筛选方法，选出携带目标DNA的宿主细菌。
5. 噬菌体的扩增和提取将DNA插入噬菌体后，需要对其进行扩增和提取，以获得足够的目标DNA量。
第七讲 噬菌体载体与柯斯载体
第七讲噬菌体载体与柯斯载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所2005年8月目录一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体2．噬菌体效价测定与双层平板法3．噬菌体的生命周期4．噬菌体的溶源生命周期5．超感染免疫6．溶源性的诱发7．Campbell模型二、λ噬菌体载体1．λ噬菌体的生物学概述2．λ噬菌体载体的构建(1)λ噬菌体载体构建的基本原理(2)插入型载体(3)替换型载体3．λ噬菌体载体的改良(1)Spi-正选择的λ噬菌体载体(2)具有内删除特性的λ噬菌体载体4．λ重组体DNA分子的体外包装(1)λ重组体DNA的转染作用(2)λ噬菌体的体外包装5．λ噬菌体DNA的包装限制问题(1)包装限制的概念(2)包装限制与λ噬菌体的克隆能力(3)包装限制的生物学意义6．λ重组体分子的选择方法(1)cI基因功能选择法(2)lacZ基因功能选择法(3)Spi-选择法三、柯斯质粒载体1．柯斯质粒的定义及其构建(1) 噬菌体的克隆能力(2)柯斯质粒载体定义(3)柯斯质粒pHC79的构建(4)柯斯质粒克隆能力及其组成2．柯斯质粒载体的特点3．柯斯质粒载体的改良4．柯斯克隆(1)定义(2)理论依据(3)柯斯质粒包装条件(4)柯斯克隆程序(5)柯斯克隆的优点5．柯斯克隆的改良(1)柯斯克隆的局限性及其克服办法(2)Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3)Bates-Swift克隆方案噬菌体载体与柯斯质粒载体一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体？(1)定义噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。
作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。
“phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
噬菌体载体
噬菌体载体第三章噬菌体载体一、填空1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是―-----------―；二是----------――。
2.首次报道的完整测序的单链DNA噬菌体是фX174，含有5386个碱基对的DNA和一个基因，是一个环状DNA分子。
基因组的最大特征是----------------。
3．λ噬菌体的基因组dna为―――――――kb，有――多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按―-----―复制，成熟包装(晚期复制)则是按―--------―复制。
它有一个复制起点，进行―-------―向复制。
λ噬菌体的dna既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性dna分子的两端各有一个――个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做――――――位点。
4.根据噬菌体的包装能力，将噬菌体基因组DNA转化为野生型λ插入载体。
该载体的最小分子量约为――KB，插入的最大外源片段不超过――KB。
5．野生型的m13不适合用作基因工程载体，主要原因是――――和--------------―。
6.Cosmid是一种质粒噬菌体杂合载体。
它的复制子来自---，cos位点序列来自---，最大的克隆片段达到----KB。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为――个，取代型为――个。
8.野生型λ噬菌体DNA不应被用作基因工程载体，原因如下：（1）-----（2）-----（3）------。
9．m13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)――――――――(2)―-------------―，(3)―――――――――――。
10.噬菌体颗粒由质粒和噬菌体DNA组成，其中质粒的主要结构是---------，而噬菌体的主要结构是---------。
11．m13单链噬菌体基因2和基因4之间的ig区有三个最重要的功能，即(1)―――――(2)―------------―(3)―-------------―。
λ噬菌体载体大学生物学
重
性
组
λ噬菌体的裂解生长状态
裂解周期
λ噬菌体的溶原状态
野生型λ噬菌体的缺陷
野生型的λ噬菌体的基因组大而且复杂，不适于直接作 为基因克隆的载体。
lλ噬菌体基因组中含有基因克隆常用的限制性核酸内 切酶的多个识别位点
l由于λ噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子，要想 获得具有感染力的噬菌体颗粒，其DNA长度应控制在λDNA的75% ～105%的范围内，即野生型λ-DNA可装载的外 源DNA片段不大于2.5kb
l重组λ-DNA分子的筛选 较为方便，提取简便
谢谢
可以编码至少30个基因
黏性 末端
头 部 蛋 白
尾 部 蛋 白
整 合 、 重 组
调 控A 免合 疫成 性
DN 晚 期
调裂 控解
裂解生长非必要区
黏性 末端
λ噬菌体的结构示意图 在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈现线性，其两端的 5′末端各带有12个碱基的互补单链（黏性末端）。
GGGCGGCGACCT
12bp的cos位点
λ噬菌体载体的主要类型
l取代型载体具有成对的克隆位点，在这两个位点 之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所置 换。
λ噬菌体载体的主要类型
以λEMBL3和 λEMBL4为代表。
EMBL3载体 左臂（20kb）
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EMBL4载体 左臂（20kb）
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
λ噬菌体载体的优点
lλ-噬菌体载体在体外包装成噬菌体颗粒后，可以高 效转染大肠杆菌，感染宿主细胞的效率几乎可达 100%，而质粒DNA的转化率只有千分之一
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
大肠杆菌的噬菌体
大肠杆菌的噬菌体
第15页
插入型载体（insertion vector）
必须携带标识基因
经改造后只含有一个可供外源DNA插入克隆位点,长度为 37kb，为包装下限，它本身也能被包装，允许插入片段 最大为14kb.
大肠杆菌的噬菌体
第16页
lacZ基因编码β-半乳
糖苷酶，能催化无色 X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物； 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。
大肠杆菌的噬菌体
第23页
5、建立-噬菌体体外包装系统
体外包装原理： λ噬菌体头部和尾部装配是分开进行。
•头部基因发生了突变噬菌体只能形成尾部和头
大肠杆菌的噬菌体
第19页
3、灭活一些与裂解周期相关基因
将无义突变引入噬菌体裂解周期所需基因， 如将头部包装蛋白基因CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在含有特异校正基因编码产物菌株内 繁殖。
当这种λDNA进入普通大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体生物污染及扩散。
BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点 （G↓AATTC）。 • 野生型只能接纳一定长度DNA。若相当于λ噬菌体 75-105%，那么只能接纳48.5kb×5%=2.425kbDNA。 • 重组λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外包 装成病毒颗粒，然后经过感染方法注入DNA。
大肠杆菌的噬菌体
➢基因工程试验中使用受体是含有琥珀型突变体
校正功效菌株。
大肠杆菌的噬菌体
第20页
4、加装选择标识
野生型λ-DNA上缺乏适当选择标识，所以加 装选择标识是λ-DNA克隆载体构建主要内容。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
•右臂：长约10kb，控 制溶菌和溶原生长最重 要的调控基因和序列、 以及λDNA复制起始均 在这区域内。
➢ 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似 性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生 长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌体载体
λ早使用的载体 系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于 全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组 噬菌体颗粒的感染活性在替换或插入某些标志基因，如上述的可 供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。
• 建立重组λDNA分子的体外包装系统。
• 与一般的质粒载体不同, 噬菌体转染前需要利用噬菌体外 壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物
• )在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌 体载体
2020/11/20
植物基因工程中的λ噬菌体载体
载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重 组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工 具。 植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的 基因需要采用不同的载体。 组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：
右臂，填充片断的存在会影响连接效率， 必须纯化左臂和右臂。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（3）外源片断与载体的连接 • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联
体，以利于将两个cos位点之间的片断装入 噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力 的噬菌体颗粒
噬菌体载体和柯斯载体
•λ 噬 菌 体 分 子 量 31×106dal，中等大 小的温和噬菌体，目 前已经定位61个基因， 其中一半参与了生命 周期，为必要基因； 余下的为非必要基因。
溶菌阶段(复制和释放)来自溶源阶段(整合寄主染色体)
一、λ噬菌体的分子生物学概述 λ phage
1、基因组结构 （1）cos位点 • 线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的 彼此完全互补的5’突出单链 • 注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成 为cos位点。
四、噬菌体的溶源生命周期
溶源生长周期：是指在感染过程中没有产 生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一 个组成部分。
现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源 周期
1、概念 温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进
入溶源生命周期。 溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组
有 些 噬 菌 体 的 DNA 碱 基 不 是 由 标 准 的 A/T/C/G组成的。 Example：
T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞
嘧啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基， 取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。
二、噬菌体的感染性 噬菌斑形成
噬菌体
感染高浓度细菌
在未发生第一次裂解 前涂布平板
一、 噬菌体的结构和其核酸类型 结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、
双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是 比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较 复杂；对寄主的依赖性较低
五、重组噬菌体的分离
基因克隆的载体噬菌粒载体
基因克隆的载体噬菌粒载体
第3页
4. 存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外 源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组子；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第2页
常见噬菌粒载体pUC118和pUC119
是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体基 因间隔区（IG）重组而成噬菌粒载体。
1. 含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克 隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作；
2. 编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带 pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才 能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择；
6. lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入 外源基因便会以融合蛋白质形式表示；
7. 含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下， 克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复 制形成大量双链DNA分子
基因克隆的载体噬菌粒载体
第4页
8. 带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅 助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出 单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌 到培养基中；
第6页
pBluescript噬菌粒载体
基T3和T7噬菌体开 启子，能够定向指导外源基因转录活动；
2. 同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点 和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情 况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单 链或双链DNA；
3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化 子记号；
Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体
4. M13载体的构建 （1）选定克隆区域 1）M13基因间隔区（intergenic region, IG区） 514 nt (5501-6014)
4
M13 6.4 Kb
2）酶切位点 IG区内有两个 BsuI(HaeIII)（GG↓CC）位点 其余8个BsuI位点分布在其它部位
基因4
M13 IG区序列
第四章 基因工程载体
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第二节 噬菌体载体
一、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 等噬菌体 pIII(5) pVIII(2700) pVII
pVI(5) +DNA
M13丝状噬菌体
pIX(5)
1. M13单链噬菌体DNA的基因组织
（3）常用的 pBluescript 载体 pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） SK：表示lacZ′ 的转录方向是沿MCS上的 SacI → KpnI KS：反向（ KpnI → SacI ，MCS相反） +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ′， 能回收lacZ′ 的编码链（+） -（f1-）：能回收lacZ′ 的非编码链（-）
5. 对M13mp1载体的改进 M3mp2：在LacZα中引入单一酶切位点EcoRI M3mp1的LacZα的第6氨基酸有个EcoRI星号位点： ATGACCATGATTACGGATCCA TACTGGTACTAATGCCTAAGT O
O N N CH3 NH2
CH3 Eco RI* H2 N-Met Thr Met Ile Thr Asn Ser------N-甲基-N-亚硝基脲 l M13mp 2 ATGACCATGATTACGAATTCA 5 ′ ATGACCATGATTACGAATTCA5′ATGACCATGATTACGGATTCA----7250 bp GT TACTGGTACTAATGCTTAA 3 ′ TACTGGTACTAAhr Asp Ser------4
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第一节 噬菌体的一般生物学特性(240页)
噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。 1. 噬菌体的结构及其核酸类型： * 一般分为三种类型：
无尾部结构的二十面体型。 具尾部结构的二十面体型。 线状体型。 * 大多数噬菌体都属于第二种类型。
(241页)
(240页)
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 噬菌体的核酸：
温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。
溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。
原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。
溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。
噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上
↓ DNA注入到被感染的细菌细胞
↓ 噬菌体DNA复制
↓ 合成出新的头部及尾部蛋白质
↓ 组装成子代噬菌体颗粒
↓ 寄主细胞壁被破坏并发生溶菌
↓ 释放出子代噬菌体颗粒
(241页)
噬菌体：细菌病毒。
234页
烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
3. 噬菌体的溶菌生命周期
(242页)
噬菌体的生命周期分为： 溶菌周期。 溶源周期。 两种类型的噬菌体： 烈性噬菌体：只有溶菌周期。 温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。
3. 噬菌体的溶菌生命周期
(242页)
基本过程为：
种克隆载体。 *目前常用的有：
EMBL系列、 λgt系列、 Charon系列。 ◆单链噬菌体：M13噬菌体。
2. 噬菌体的感染性
(241页)
一个噬菌体颗粒
→ 感染一个细菌细胞 → 迅速形成数百个子代噬菌体颗粒 → 每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞 → 再产生出数百个子代颗粒。
如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便 能够使数十亿个的细菌细胞致死。
（1）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。 （2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。 （3）转变：被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。 （4）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核
酸和蛋白质。
（5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。 （6）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放
由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。
此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。
2. 噬菌体的感染性
噬菌体对寄主细胞的感染作用： 烈性噬菌体的生命周期：
噬菌斑：感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下 的空斑。
菌苔（lawn）：覆盖培养基表面的单层细菌。
(英含遗工词)
2. 噬菌体的感染性
(241页)
将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。
Ⅰ、若干基本概念
234页
噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后
引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌
产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
4. 噬菌体的溶源生命周期
(244页)
另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。
基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
出来。
(242页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
(243页)
温和噬菌体感染寄主细胞之后出现的溶源周期中，
不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍 然存活着并继续进行细胞分裂。
经过了许多世代之后，如果环境条件正常的话， 溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。
寄主细菌会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌 体颗粒。
码外壳蛋白质的基因。
噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合 入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两 种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它 们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
基因工程又称重组DNA技术 其实施至少要有四个必要的条件
1. 工具酶 2. 基因 3. 载体 4. 受体细胞
（《基因工程..》静国忠，85页）
(240页)
噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。
噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分
子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编
最常见的是：双链线性DNA。 还有双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。 有些噬菌体DNA碱基不是由标准的A、T、 C、G四种碱基组成。 如T4噬菌体DNA中没有C，取代的是5-羟甲 基胞嘧啶（HMC）。
(刘志国，102-105页）
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 常用作基因工程的噬菌体： ◆双链噬菌体：λ噬菌体。 * 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多
4. 噬菌体的溶源生命周期
(243页)
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）：
（1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。
（2）经过短暂的转录。
（3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。
（4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)