040-01非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(15版中国药典公示稿)
胰酪大豆胨 琼脂培养基 和胰酪大豆 胨液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时间不超过 3 天，接种 量不大于 100cfu
胰酪大豆胨 琼脂培养基 / 胰酪大豆 胨液体培养 基 （ MPN 法），培养 温 度 30 ～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 3 天，接种量 不大于 100cfu
计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验
试验菌株
试验菌液 的制备
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 〔CMCC(B)26 003)〕
胰酪大豆 胨琼脂培 养基或胰 酪大豆胨 液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时 间 18 ～ 24 小时
获得丰富
的孢子
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，
检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学
特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。
胰酪大豆胨 琼脂培养基 （ MPN 法 不 适用），培 养温度 30～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 5 天，接种量 不大于 100cfu
沙氏葡萄 糖琼脂培 养基，培养 温度 20～ 25℃，培养 时间不超 过 5 天，接 种量不大 于 100cfu
沙氏葡萄 胰酪大豆胨 沙 氏 葡 萄 胰酪大豆胨 沙氏葡萄
糖琼脂培 琼 脂 培 养 糖 琼 脂 培 琼脂培养基 糖琼脂培
黑曲霉
养基或马 基，培养温 养基，培养 （ MPN 法 不 养基，培养
非无菌产品微生物限度检查标准操作规程
非无菌产品微生物限度检查标准操作规程1 制定目的为使QC检验人员在非无菌产品微生物限度检查工作中能规范和正确地进行检验工作，特制定本操作规程。
2 适用范围本操作规程适用于非无菌产品进行微生物限度检查。
3 职责3.1 QC负责按照本操作规程进行非无菌产品微生物限度检查的检验工作；3.2 QC检验员在进行非无菌产品微生物限度检查的检验工作时出现异常现象，包括微生物计数、微生物负载、控制菌检测超标和超趋势时要向QC 主管汇报，并照《微生物检查超标、超趋势调查标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-020）配合调查；3.3 QA及管理人员负责监督其实施情况。
4 规程细则4.1 实验环境：按《微生物实验室标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-002），《化验室洁净区标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-004）。
4.2 培养基的制备：按《培养基标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-019）；微生物计数用的商品化预判培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
4.3 稀释剂的制备：称取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g，置1000ml三角瓶中，加纯化水1000ml，摇匀，加热溶解，于121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
4.4 微生物计数法：适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数；计数方法应进行方法适用性试验；按《微生物计数方法适应性确认》（文件编号：）。
4.4.1 供试液的制备（经计数方法适用性试验确认）4.4.1.1 取样：按《取样标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-026）；一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。
4.4.1.2 供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃；供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.4.1.3 水溶性供试品：取供试品，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH 7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
学习：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
学习：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法
……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……
提示：后文增加了对于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因注意结合此处的要求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……
学习：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品。
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法浙江省食品药品检验研究院郑小玲计数方法的概况主要内容1计数培养基适用性检查2供试品计数方法适用性检查3供试品检查4结果判断5平皿法薄膜过滤法MPN 法有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数不适用活菌制剂的检查受控环境洁净环境下的局部洁净度不低于B 级可采用替代方法确认方法的适用性细菌数：营养琼脂培养基，30～35℃，3天霉菌和酵母菌数：玫瑰红钠琼脂培养基，20～28℃，5天。
酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂需氧菌总数（TAMC)：胰酪大豆胨琼脂（TSA），胰酪大胨肉汤（TSB）30～35℃，3～5天霉菌和酵母菌总数（TYMC)：沙氏葡萄糖琼脂培养基，20～25℃，5～7天修订后•菌种及菌液制备菌种：标准菌株(CMCC)，传代次数不超过5代金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲菌液制备：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制菌悬液。
菌液制备后室温放置，2小时内使用；2～8℃，24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
•阴性对照以稀释剂进行阴性对照组，应无菌生长TSA、TSB、SDA：1、实验用菌株：TSA:金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲TSB：金葡、铜绿、枯草SDA:白念、黑曲2、接种：TSA、SDA:涂布法、倾注法。
TSB：直接接入接种量不大于100cfu，细菌30～35℃培养不超过3天，真菌20～25℃培养不超过5天。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
对照培养基替代被检培养基同法操作。
3、TSA、SDA与对照培养基比较，回收率为50%～200%，菌落形态与对照培养基一致。
TSB与对照培养基比较，试验菌应生长良好。
玫瑰红钠培养基、SDA+抗生素、选择性培养基供试液制备1.液体供试品2.固体、半固体或黏稠性供试品3.需用特殊方法制备供试液的供试品（1）非水溶性供试品（2）膜剂（3）肠溶及结肠溶制剂（4）气雾剂、喷雾剂（5）贴剂（6）具抑菌活性的供试品1.水溶性供试品2.水不溶性非油脂类供试品3.油脂类供试品4.需用特殊方法制备供试液的供试品（1）膜剂（2）肠溶及结肠溶制剂（3）气雾剂、喷雾剂（4）贴膏剂修订后如药典上所列方法经确认不适用，可采用其他适宜方法。
非无菌产品微生物检查微生物计数法
2021/12/29
31
微生物计数方法
主要内容
格式变化 通用要求 计数方法 试验菌液的制备和试验 培养基适用性检查 供试液的制备 计数方法适用性试验 供试品检查 结果判断
格式变化
修订前：一个通则 修订后：三个通则
微生物限度检查法
非无菌产品微生物检查：微生物计数法
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 药品微生物限度标准 标准部分合并一部和二部内容 结果报告问题：【微生物限度】
判断标准 与对照培养基比较，菌数比值在0.5-2(50％-200％)范围内,且菌落大小、形态一致。
注：如用于控制菌白色念珠菌的检查时，同时需要满足控制菌项下培养基适用性检查要求。
含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂：培养基适用性检查同沙氏葡萄糖琼脂。
计数方法的增修订内容
修订前 1、平皿法： 倾注法 2、薄膜过滤法 修订后
修订后 需氧菌总数测定：胰酪大豆胨琼脂和胰酪大胨肉汤（30-35℃ ） 霉菌和酵母菌总数测定：沙氏葡萄糖琼（20-25℃ ） 、 玫瑰红钠琼脂。
培养基适用性检查
目的：确定培养基质量是否符合检验用要求。 培养基的无菌性试验 培养基的灵敏度试验 培养基适用性检查 -促生长试验 -抑制性试验 -指示能力
计数方法适用性试验—试验菌株
修订前 细菌计数：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。（营养琼脂）。 霉菌和酵母菌计数：白色念珠菌、黑曲霉。（玫瑰红钠琼脂）。 修订后 好氧菌总数测定 平皿法、薄膜过滤法： 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。（胰酪大豆 胨琼脂）。 MPN法： 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌（胰酪大豆胨肉汤）。 霉菌和酵母菌总数测定: 白色念珠菌、黑曲霉（ 沙氏葡萄糖琼脂）。
2015年版中国药典 通则1105 非无菌产品微生物限度检査：微生物计数法
养 温 度 3 0 〜 3 5 C ， 3 5 X ：, 培 养 时 间 不 超 过
培 养 时 间 1 8 〜 24 3 天 ， 接 种 量 不 大 于
小时
100c£u
计数方法适用性试验
需氧菌总数计数
霉菌和酵母菌 总数计数
胰酪大豆胨琼脂培养 基或胰酪大豆胨液体培 养 基 （M P N 法 ）， 培 养 温 度 30〜 35°C, 培 养 时 间 不 超 过 3 天 ，接 种 量 不 大 于 lOOcfu
苗种及苗液制备 苗 种 试 验 用 菌 株 的 传 代 次 数 不 得 超 过 5 代 （从 菌 种 保 藏中心获得的干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜 的 菌 种 保 藏 技 术进行保存，以 保 证 试 验 菌 株 的 生 物 学 特 性 。计 数 培 养 基 适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。 菌液 制 备 按 表 1 规 定 程 序 培 养 各 试 验 菌 株 。取 金 黄 色 葡萄球菌、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯 草 芽 孢 杆 菌 、 白色 念珠菌 的新 鲜培养物，用 P H 7 .0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0 .9 % 无菌 氣化 钠 溶 液 制 成 适 宜 浓 度 的 菌 悬 液 ；取 黑 曲 霉 的 新 鲜 培 养 物 加 人 3〜5 m l含 0. 05% ( m l/m l) 聚 山 梨 酯 8 0 的 p H 7_0无 菌 氯 化 钠 -蛋 白胨 缓 冲 液 或 0 .9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。 然后，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0. 05%(m l/m l)聚 山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无菌氣化钠-蛋白胨缓冲 液 或 0. 9%无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 适 宜 浓 度 的 黑 曲 霉 孢 子 悬 液 。 菌 液 制 备 后 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若保 存 在 2〜8 * C ，可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2〜8 ° C , 在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 阴性对照 为 确 认 试 验 条 件 是 否 符 合 要 求 ，应 进 行 阴 性 对 照 试 验 ， 阴 性对照 试 验应 无菌 生 长。如 阴 性 对 照 有 菌 生 长 ，应进 行偏 差调查。 培养基适用性检査 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配 制的培养基均应进行培养基适用性检查。 按 表 1 规 定 ，接 种 不 大 于 lOO cfu的 菌 液 至 胰 酪 大 豆 胨 液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法汇总
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法汇总湖南湘大兽药有限公司工作标准文件题目非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法标准操作规程编号ZLJG F-046-00修定质检部审核批准修定日期2016.12 审核日期批准日期颁发部门GMP办公室颁发数量 2 份生效日期分发部门质检部、档案室文件页数共11页一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。
二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P179）。
三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的质量检测。
四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。
五、正文：1简述：微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
2.计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
非无菌制剂的微生物限度检查法：微生物计数法
〈61〉非无菌制剂的微生物限度检查法:微生物计数法引言本检查法可用于需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
本检查法主要用于确定原料或制剂是否符合相应的微生物限度标准。
当用于此项检查时,按下述规定进行检验,包括样品的取样量和结果的判断。
本检查法不适用于以活的微生物作为活性成分制剂的微生物限度检查。
本检查法可用其他微生物检查方法替代,包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于药典检验方法。
-般程序本检查应在避免外来微生物污染供试品的试验条件下进行,防止微生物污染的措施不得影响供试品中污染微生物的检出。
如果供试品具有抗菌活性,应尽可能去除或中和,为此目的使用的灭活剂需证明其有效性及对微生物的无毒性。
如果供试液制备时使用了表面活性剂,应验证其对微生物无毒性以及与灭活剂的相容性。
计数方法计数方法可采用薄膜过滤法或平皿计数法中的一种。
通常最大可能数(MPN)法用于微生物计数精确度较低；但对于生物负荷很低的样品,MPN法可能是最适合的法。
计数方法的选择基于供试品的特性和微生物限度的要求等因素。
应通过足够的样本量通过试验来判断选用的方法是否符合规定,其适用性也需被验证。
促生长试验、计数方法的适用性确认试验和阴性对照试验总则供试品中污染的微生物计数方法的适用性应进行确认。
如果检验条件或供试品发生改变可能影响检验结果时,计数方法的适用性应重新进行确认。
试验菌的制备试验菌液可用标化的稳定菌悬液或如下所述来制备。
使用适宜的菌种保藏技术(种子批系统)确保菌种的活力,从主种子库中取出接种的原始试验菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的菌种为第0代),各细菌和真菌的试验菌株培养见表1。
使用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液制各试验用菌悬液,黑曲霉孢子悬液的制备可用含0.05%的聚山梨酯80的缓冲液。
菌悬液应在2小时内使用,保存在2~8℃下的菌悬液可在24小时内使用。
适宜体积的黑曲霉和枯草芽孢杆菌稳定的孢子悬液,可替代制备并稀释好的新鲜营养体细胞悬液,用于进行试验接种。
微生物限度计数方法
微生物限度计数方法微生物限度计数方法是微生物学研究中常用的一种实验方法，它通过将样品中的微生物进行定量计数，从而评估样品的微生物污染程度。
本文将对微生物限度计数方法进行详细介绍，希望能为微生物研究提供有指导意义的参考。
微生物限度计数方法通常包括以下几个步骤：1. 样品制备：首先，需要将待测样品制备成适当的形式，以便于对微生物进行计数。
例如，对于液态样品，可以采用稀释平板法或过滤法进行计数；对于固体样品，可以使用剁碎法或振荡法等方法进行处理。
2. 稀释平板法：稀释平板法是一种常用的微生物计数方法。
该方法的基本原理是将不同稀释倍数的样品溶液分别加到含有培养基的平板上，经过培养后，可以根据每个平板上微生物的生长数量来计算样品中微生物的含量。
这种方法要求制备一系列稀释液，将样品进行逐步稀释，并接种到含有培养基的平板上。
3. 过滤法：过滤法适用于液态样品的微生物计数，尤其是样品中微生物数量较高的情况。
该方法的原理是通过滤膜，将微生物过滤出来并附着在膜上，然后将滤膜放置在培养基上进行培养。
培养后，可以通过计数膜上微生物的数量来评估样品中微生物的含量。
过滤法具有操作简便、有效快速等优点，适用于大量样品的计数。
4. 其他方法：除了稀释平板法和过滤法，还有一些其他常用的微生物计数方法，如MPN法、薄膜法、电子计数法等。
这些方法各有特点，可根据实际研究需要选择合适的方法进行微生物计数。
微生物限度计数方法在微生物学研究中具有重要意义。
通过对样品中微生物的计数，可以评估其污染程度，为食品安全、医药生产、环境监测等领域提供可靠的数据依据。
同时，微生物限度计数方法也有助于监控微生物的生长趋势，预测潜在的微生物污染风险，并采取相应的控制措施。
总之，微生物限度计数方法是微生物学研究中必不可少的一部分。
通过了解和掌握不同的计数方法，科研人员可以准确评估样品中微生物的含量，并及时采取措施来控制微生物的污染传播。
相信本文的内容能够为微生物研究者提供有用的指导意义。
微生物限度检查法标准操作规程
目的??建立微生物限度检查法标准操作规程，规范操作，保证结果的准确性。
范围??成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任??微生物限度检验人员?内容???本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105??非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106??非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
?微生物计数法?一、计数方法?1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法?本法包括平皿法、薄膜过滤法。
?3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查??????供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备?4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。
?4.2菌液制备??按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
?4.3阴性对照??为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
?4.4培养基适用性检查??按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
非无菌药品微生物限度标准
附录×××非无菌药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。
2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3. 非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表1）表1 非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/m或CFU/10cm2）霉菌及和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/m或CFU/10cm2）控制菌口服固体给药制剂103102不得检出大肠埃希菌（1g）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g）口服液体给药制剂102101不得检出大肠埃希菌（1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌（1g或1ml）阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、梭菌（1g、1ml或10cm2）直肠给药固体制剂液体制剂103102102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或1ml）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）4. 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表2）表2非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/mL或CFU/10cm2）霉菌和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/mL或CFU/10cm2）控制菌固体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉含豆豉、神曲等发酵原粉104（丸剂3×104）1051025×102不得检出大肠埃希菌（1g）；不得检出沙门菌（10g）；耐胆盐革兰阴性菌应小于102（1g）。
欧洲药典 7.0 _非无菌产品的微生物限度检查
2.6.12非无菌产品的微生物限度检查：微生物计数试验1.简介：该法所描述的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制剂是否符合微生物质量的既定标准。
如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来进行结果解释。
该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。
如果与药典的等效性作了相关说明，可以使用自动收集法作为替代法。
2.一般步骤设计方法时所用条件要避免外在微生物对待测产品的污染。
必须釆取措施，使其不影响任何待测微生物。
如果待测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。
如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。
如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。
3.计数方法按规定用微孔滤膜法或平板计数法。
MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但如果某些产品所含微生物的量极少，则该法是最合适的。
方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物限量。
所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断其是否符合标准。
所选方法的适用性必须建立。
4.促生长实验、计数法的适用性和阴性对照4-1 总则该试验检测产品中微生物的检测能力必须被验证。
如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适适用性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。
4-2 试验菌株的准备使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。
使用批菌种培养技术（seed-lot systems）使得用于接种的微生物从最初的主批种子传代不多于5次。
细菌和真菌试验株的生长分别见表2.6.12-2。
使用氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或pH 7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。
对于黑曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。
在两小时内使用该菌悬液或2-8℃下可保存24小时。
作为一种可替代的制备方法，稀释含有黑曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有营养细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。
微生物限度法
微生物限度检查法标准操作规程1 目的建立非无菌产品微生物限度检查法的标准操作规程，使其规范化、合理化。
2 范围适用于非无菌产品微生物限度检查法的检验操作。
3 职责3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责；3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。
4 定义无。
5 内容5.1 概述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
5.2 检验量5.2.1 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)；5.2.2 一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验；5.2.3 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；检查沙门菌的供试品，检验量应增加20g或20ml（其中10g用于阳性对照试验）。
贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
5.3 样品处理5.3.1 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃，供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。
如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
5.3.1.1 水溶性供试品：取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。
若需要，调节供试液pH值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
5.3.1.2 水不溶性非油脂类供试品：取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。
非无菌产品微生物限查微生物计数法
应 的 微 生 物 限 度 标 准 时 ，应 按 下 述 规 定 进 行 检 验 ，包括样品 的 取 样 量 和 结 果 的 判 断 等 。除 另 有 规 定 外 ，本法不适用于活 菌制剂的检査。
微 生 物 计 数 试 验 环 境 应 符 合 微 生 物 限 度 检 查 的 要 求 。检 验 全 过 程 必 须 严 格 遵 守 无 菌 操 作 ，防 止 再 污 染 ，防止污染的 措 施 不 得 影 响 供 试 品 中 微 生 物 的 检 出 。单 向 流 空 气 区 域 、工 作台面及环境应定期进行监测。
胰酪大豆胨琼脂培养 基或胰酪大豆胨液体培 养 基 （M P N 法 ）， 培 养 温 度 3 0 〜 35X ：， 培 养 时 间 不 超 过 3 天 ，接种量不 大 于 lOOcfu
医疗器具
带导管的一次性医疗器具 二分之一内表面积
(如输液袋）
其他医疗器具
整个器具®(切碎或拆散开）
① 如 果 医 用 器 械 体 积 过 大 ，培 养 基 用 量 可 在 2 0 0 0 m l以 上 ，将其 完全浸没。
1 1 0 5 非无菌产品微生物限 度 检 查 ：微 生物 计 数 法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和 真菌的计数。
胰酪大豆胨琼脂
胰酪大豆胨琼脂培养
培养基或胰酪大豆 基和胰酪大豆胨液体培
胨 液 体 培 养 基 ，培 养 基 ，培 养 温 度 30〜
养 温 度 3 0 〜 3 5 *C ， 3 5 aC ， 培 养 时 间 不 超 过
培 养 时 间 1 8 〜 24 3 天 ， 接 种 量 不 大 于
非无菌产品微生物限度检查标准
附录ⅪJ 非无菌药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。
2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准（见表1）表1 非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、CFU/ml或CFU/10cm2）霉菌及和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/ml或CFU/10cm2）控制菌口服固体给药制剂103102不得检出大肠埃希菌（1g）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g）口服液体给药制剂102101不得检出大肠埃希菌（1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌（1g或1ml）阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌（1g、1ml或10cm2）直肠给药固体制剂液体制剂103102102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或1ml）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）4. 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表2）表2 非无菌药用原料及辅料微生物限度标准需氧菌总数（CFU/g 或 CFU/ml）霉菌和酵母菌总数（CFU/g或CFU/mL）控制菌药用原料及辅料103102* 注*：限度未做统一规定。
微生物限度检查法
1 目的建立非无菌产品微生物限度检查法的标准操作规程，使其规范化、合理化。
2 范围合用于非无菌产品微生物限度检查法的检验操作。
3 职责质量管理部相关人员对本法负责；4 定义无。
5 内容5.1 概述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或者中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或者灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或者灭活剂的相容性。
5.2 检验量5.2.1 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml 或者cm2)；5.2.2 普通应随机抽取不少于2 个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验；5.2.3 除另有规定外，普通供试品的检验量为10g 或者10ml；检查沙门菌的供试品，检验量应增加20g 或者20ml (其中10g 用于阳性对照试验)。
贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
5.3 样品处理5.3.1 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃，供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。
常用的供试液制备方法如下。
如果下列供试液制备方法经确认均不合用，应建立其他适宜的方法。
5.3.1.1 水溶性供试品：取供试品，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或者pH7.2 磷酸盐缓冲液，或者胰酪大豆胨液体培养基溶解或者稀释制成1:10 供试液。
若需要，调节供试液pH 值至6~8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10 倍系列稀释。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
5.3.1.2 水不溶性非油脂类供试品：取供试品，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或者pH7.2 磷酸盐缓冲液，或者胰酪大豆胨液体培养基溶解或者稀释制成 1 ：10 供试液。
微生物限度检查法
非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及原、辅料等符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适应于活菌制剂的检查。
微生物计数实验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止在污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试品制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法。
MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是最适合的方法。
供试品检查时应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
(2022年版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程
（2022年版药典）非无菌药品微生物限度检查操作规程某某某某某某某某某某公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033非无菌药品微生物限度检查操作规程起草人审核人批准人日期日期日期年月日执行日期2022年12月01日年月日年月日颁发部门质保部分发部门质保部（）份质检部（）份变更记载：修订号执行日期生产部（）份物资部（）份设备部（）份采供部（）份002022年06月01日销售部（）份行政部（）份012022年05月01日财务部（）份022022年12月01日1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。
2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。
3.责任者：QC检验员、QC经理。
4.正文：4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法4.1.1简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
第1页共27页某某某某某某某某某某公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-0334.1.2计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Mot-Probable-NumberMethod，简称MPN法）。
040-01非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
1. 简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
2计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method, 简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
2.1 计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
2.2 菌种及菌液制备2.2.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
2.2.2 菌液制备按表1规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人3～5ml含0. 05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
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1. 简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及和所使用中和剂或灭活剂的相容性。
2计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method, 简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
2.1 计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
2.2 菌种及菌液制备2.2.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
2.2.2 菌液制备按表1规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人3～5ml含0. 05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0 无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0. 9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用。
2.2.3 阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.2.4培养基适用性检査微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
按表1 规定，接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 规定条件下培养。
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数和对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2 范围内，且菌落形态大小应和对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管和对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
2.2.5 计数方法适用性试验2.2.5.1 供试液制备根据供试品的理化特性和生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。
常用的供试液制备方法如下。
如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
（1）水溶性供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1: 10供试液。
若需要，调节供试液pH值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
（2）水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1: 10供试液。
分散力较差的供试品，可在稀释液中加人表面活性剂如0.1 %的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。
若需要，调节供试液pH 值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
（3）油脂类供试品取供试品，加人无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或和最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。
表面活性剂的温度一般不超过40℃：(特殊情况下，最多不超过45℃)，小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加人预热的稀释液使成1: 10 供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。
必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。
（4）需用特殊方法制备供试液的供试品a、膜剂供试品取供试品，剪碎，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH 7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1: 10的供试液。
若需要，调节供试液pH 值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
b、肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品，加人pH 6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂），置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1: 10 的供试液。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
c、气雾剂、喷雾剂供试品取供试品，置一20℃或其他适宜温度冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。
供试品亦可采用其他适宜的方法取出。
用无菌注射器从每一容器中吸出药液于无菌容器中混合，然后取样检査。
d、贴膏剂供试品取供试品，去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面朝上覆盖一层适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。
将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少30分钟。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
2.2.5.2 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
（1）试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于lOOcfu。
（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
（3）菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。
若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试%液进行进一步的处理。
如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。
2.2.5.3 抗菌活性的去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收” 规定的方法进行微生物计数。
若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50% ,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。
（1）增加稀释液或培养基体积。
（2）加人适宜的中和剂或灭活剂。
中和剂或灭活剂（表2 )可用于消除干扰物的抑菌活性，最好在稀释液或培养基灭菌前加入。
若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。
中和剂或灭活剂对照组的菌落数和菌液对照级的菌落数的比值应在0.5～2范围内。
干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂酚类、乙醇、醛类、吸附物醛类季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸水银水银、汞化物、醛类EDTA、喹喏酮类抗生素磺胺类β－内酰胺类抗生素亚硫酸氢钠稀释法甘氨酸卵磷脂聚山梨酯巯基醋酸盐硫代硫酸盐镁或钙离子对氨基苯甲酸β－内酰胺酶（3）采用薄膜过滤法（4）上述几种方法的联合使用若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。
但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。
因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检査。
2.2.5.4供试品中微生物的回收表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。
微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。
（1）平皿法平皿法包括倾注法和涂布法。
表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。
倾注法取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注人15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。
按表1规定条件培养、计数。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组的平均菌落数。
涂布法取15～20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。
若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。
每一平板表面接种上述照“供试液的制备” “接种和稀释” 和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液不少于0.1ml。
按表1规定条件培养、计数。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组的平均菌落数。
（2）薄膜过滤法薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45pm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。
供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。
油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。
为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。
供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。