ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
无缝克隆说明书+原理+实例
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
PCR产物不经过酶切,直接快速,定向克隆入任何载体的方法
PCR产物不经过酶切，直接快速，定向克隆入任何载体的方法默认分类2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 字号：大中小订阅上海捷瑞生物工程有限公司提供的EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒，专门为把PCR 产物快速，定向，有效的克隆到任何目标载体而设计。
有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择，磷酸化，补平，加A，使用中间载体等等一系列复杂步骤。
无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30分钟一站式解决所有问题。
技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列，PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。
PCR 产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀，22 ℃温浴30 min后，按传统方法转化E. coli competent cells，就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。
如下图：适用范围：1、PCR cloning into any vector2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning3、Gene transfer from one vector to another4、High-throughput (HTP) PCR cloning5、In vitro joining of DNA fragments优点：1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点，只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平或加A处理，不用去磷酸化载体，不用连接；2. 适用于各种PCR酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物；3. 混合温育30分钟即可转化，节约时间和精力；4. 精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向，表达产物没有多余的氨基酸；5. 重组效率高、转化率高，可用于高通量操作，批量克隆, 重复性高、可靠性好；6. 根据实验需要选择适合的表达载体，选择最佳酶切位点，酶切载体后得到线性化载体（单酶切或者双酶切均可），得到PCR产物和线性化载体后，加入EZfusion Enzyme酶，混合，22°C保温30分钟后转化，就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。
CloneSelect Imager, ClonePix2细胞筛选系统和QPix微生物克隆挑选
７天追踪克隆生长－聚集每个成像时间点叠加成像
系统参数
成像 软件 白光成像 数据追踪 相机 成像速度 分辨率 仪器 源板类型 源板载量 仪器尺寸 仪器重量 整合性 监管部门获批
3% Day 1 5% Day 2 15% Day 3 55% Day 7
ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ 专用成像软件预装在高性能ＰＣ上，Ｗｉｎ ７操作系统 透射光 １个内部的条形码阅读器可以追踪每个板数据 整合１６位冷ＣＣＤ相机 ９６孔板：２．５分钟 标准：３．６微米；最大：１．８微米
９６孔板或者３８４孔板 １块 ７２０ｍｍ（宽）×４５８ｍｍ（高）×５７０ｍｍ（深） ５５ｋｇ ＯＥＭ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ａｖａｉｌａｂｌｅ
ＣＥ标志
09
ＱＰｉｘ微生物筛选系统
ＱＰｉｘ系列微生物筛选系统可自动挑选特异性微生物，具有运行速度快、精度高、性能稳定等优点，是微生物筛选的理 想工具。作为自动化微生物筛选产品的鼻祖，Ｇｅｎｅｔｉｘ发展出多项独特的技术和工具，并据此设计了一系列适合不同通 量以及实验应用要求的筛选系统，包括：
具有特定细胞表面标记的细胞 根据细胞内报告基因的表达筛选克隆（ｅ．ｇ． ＧＦＰ） 昆虫杆状病毒筛选，杆状病毒蛋白表达系统，自动挑取琼脂糖培养基上形成的病毒斑
ＣｌｏｎｅＰｉｘ系统
选择多孔板
条形码 可追踪 克隆
机械挑选臂可精确、 轻轻挑取和转移克隆
堆板器可操作 １￣６－孔培养 板和９６孔转
移板
自动化 移去和 替代板盖
04
工作站 可清洗 和消毒
系统参数
成像 软件
白光成像
荧光成像
数据追踪 相机 成像速度 分辨率 仪器 污染 源板类型 终板类型 源板载量 终板载量 挑取头 挑取针大小 挑取速度 洗浴 挑取系统液流 针头干燥 仪器尺寸 仪器重量 压缩机 压缩元件 尺寸 重量 最小运作压力 最小操作体积 监管部门获批
ClonExpress One Step Cloning一步法定向克隆无缝克隆讲座
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform 3.5 hr over all
Vector with Multi Insertions Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
BamHI (1794) SalI (596) SalI (355) Eco RI (16) Xho I (347) Xho I (1424) SalI (1473) SalI (1965) SalI (2220) Xho I (2381)
ORF
ORF
2514 bp
Poor sites for digestion: buffer choice Poor sites for ligation: blunt-sticky ends ligation
First and most important thing: Select you cloning site GC content/repeat sequence 40-60%/try to avoid
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆随着生物技术的不断发展，分子生物学技术成为现代生命科学研究中的重要工具之一，通过对生物分子的研究，人们可以深入了解生命体的组成和运作方式，为解决人类和社会面临的诸多问题提供依据和解决途径。
其中，DNA序列分析和基因克隆是现代生命科学研究中最为基础和重要的研究方法之一。
而为了加速DNA序列分析和基因克隆，快速克隆技术应运而生。
快速克隆技术是一类利用高效的DNA重组技术将外源DNA序列导入宿主细胞，并产生可重现、高效、无需寻找突变位点的定向克隆方法。
它不仅缩短了基因克隆的时间，而且方便了对DNA序列的修饰。
快速克隆技术的主要优势在于，可以直接对目标DNA序列进行点突变、插入、删减等修饰，从而实现对基因功能的探究，为分子生物学研究提供有力手段。
快速克隆技术主要包括克隆扩增和重组克隆两种方法。
克隆扩增是一种在PCR反应中同时进行克隆扩增和定向作用的技术，通过使用末端限制性核酸内切酶和pCR®4-TOPO®克隆载体，可以实现PCR产物的快速克隆扩增。
重组克隆则利用了DNA重组酶的高效作用，在宿主细胞内完成DNA重组反应，将目标DNA序列在不损失信息的情况下导入到载体中，从而实现快速、准确、方便的基因克隆。
在快速克隆技术的应用中，需要注意一些技术要点。
首先，对于目标DNA序列的选择需要仔细考虑，得到的DNA序列必须保持完整性，并且没有任何突变；其次，在重组克隆中，DNA重组反应必须充分进行，可以通过调节DNA浓度、DNA重组酶的用量和反应时间等因素来达到最佳反应效果；此外，对于载体的选择也非常重要，通常会选择T/A克隆载体，如pCR®4-TOPO®克隆载体，在克隆扩增反应中具有很好的适用性，而在重组克隆中，较常用的载体有pET-28a，pGEX等。
使用快速克隆技术进行基因克隆，需要进行单克隆鉴定。
clonepix工作原理 -回复
clonepix工作原理-回复clonepix是一种图片克隆技术，它能够复制和粘贴图像素材以快速生成新的图像。
这种技术基于计算机图像处理和深度学习算法，通过分析和学习原始图像的特征来创建一个可以生成类似效果的模型。
本文将详细介绍clonepix的工作原理，从图像采集到生成和优化的整个流程。
首先，为了开始克隆过程，我们需要采集一张原始图像作为输入。
这张图片可以是用户自己提供的，也可以从网络上下载。
在采集过程中，我们还可以使用一些图像处理技术来优化图像质量，例如调整亮度、对比度、饱和度等。
接下来，将采集到的原始图像输入到模型中进行处理。
模型通常由深度神经网络构建，包括输入层、隐藏层和输出层。
输入层接收原始图像数据，并将其转化为适合网络处理的格式。
隐藏层是模型的核心，它由多个神经元组成，每个神经元执行一系列计算来提取图像的特征。
这些特征可以是颜色、纹理、形状等。
在克隆过程中，模型不仅学习原始图像的特征，还学习如何将这些特征应用于新的图像生成。
模型会使用反向传播算法来调整权重和偏置，以最小化生成图像与原始图像之间的差异。
这个训练过程需要大量的数据和计算资源来获得准确和高效的结果。
一旦模型训练完成，就可以开始生成新的图像。
用户可以选择以原始图像为基础，并指定要克隆的特定区域。
模型会根据用户的指示和学习到的特征，将原始图像中的特定区域与其他区域进行匹配、复制和粘贴。
这个过程涉及到图像分割、特征匹配和像素操作等多个步骤，以确保生成的图像在视觉上与原始图像一致。
除了基本的克隆功能，clonepix还提供了一些额外的工具和功能来优化生成图像的质量。
例如，用户可以调整克隆的透明度、尺寸和位置，以实现更精确的效果。
此外，clonepix还支持批量处理和自动化操作，使用户能够快速生成大量的克隆图像。
要注意的是，clonepix是一种生成性模型，它并不是一个完美的复制工具。
生成的图像可能会有一些细微的差异和瑕疵，这是由于模型的训练和图像生成过程中存在的限制所导致的。
dna assembly mix无缝克隆原理
dna assembly mix无缝克隆原理DNAAssemblyMix是一种新型的基因克隆试剂，它的出现为基因克隆领域带来了革命性的变化。
这种混合物集成了多种功能，能够简化基因克隆过程，提高克隆效率，并降低错误率。
本文将详细介绍DNAAssemblyMix无缝克隆原理，帮助读者更好地理解其优势和应用。
一、无缝克隆原理DNAAssemblyMix无缝克隆原理的核心在于其独特的组装方式。
传统的基因克隆方法需要人工构建载体，操作过程繁琐，容易出错。
而DNAAssemblyMix则采用了一种自动化、智能化的组装方式，将目的基因和载体DNA预先混合，通过特定的酶反应，将两者连接起来，形成重组子。
这种方式大大简化了克隆步骤，降低了人为误差，提高了克隆效率。
二、关键技术1.酶切位点设计：DNAAssemblyMix的关键技术之一是酶切位点的合理设计。
通过对载体DNA和目的基因进行精确分析，选择合适的酶切位点，能够保证在特定条件下，目的基因能够准确无误地连接到载体上。
2.自动化组装：DNAAssemblyMix采用自动化设备进行组装，能够实现大规模生产。
这种自动化设备能够精确控制反应温度、时间等条件，确保基因克隆的准确性和稳定性。
3.质量控制：DNAAssemblyMix的生产过程中，严格控制每个环节的质量，包括原料筛选、生产环境、生产过程等。
通过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
三、应用领域DNAAssemblyMix无缝克隆原理的应用领域非常广泛，包括生物医药、农业、环保等领域。
在生物医药领域，DNAAssemblyMix可以用于基因治疗、药物筛选等研究；在农业领域，DNAAssemblyMix可以用于基因编辑、抗病抗逆性等方面的研究；在环保领域，DNAAssemblyMix可以用于环境监测、生物修复等方面的研究。
四、优势与前景DNAAssemblyMix的优势在于其自动化、智能化、高效、稳定等特点。
无缝克隆,同源重组克隆
简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。
（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。
首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。
然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。
最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
载体构建简介
载体构建SOP载体构建(vectorconstruction)，为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。
理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。
主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。
载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
原核重组表达常用载体构建策略有多种选择，（1）常用的酶切连接是较为广泛使用的克隆技术，主要优点是技术稳定，缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的失败，如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，需特别留意的是基因内部不能有与上述相同的酶切位点；（2）同源重组是目前流行的克隆技术。
同源重组（Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
该技术可以任意载体任意基因片段快速实现多片段长片段定点定向克隆，最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，将目的片段和线性载体按照一定比例混合后，在重组酶的作用下即可发生重组，本实验室常用37℃的温度，30min反应即可完成。
一、目的载体进行双酶切（一）实验准备1.实验材料：质检合格的目的载体。
2.试剂与耗材：buffer，ddH2O，琼脂糖（Spain，9012-36-6）、TBE缓冲液、PCR 管（国产，81245）、1.5ml离心管（国产）、枪头（国产）、Axygen AxyPrep PCR cleanup Kit(Axygen，AP-PCR-250)、限制性内切酶A、限制性内切酶B。
3.仪器与设备：PCR仪（杭州博日，TC-96/G/H（b）A）、mini离心机（其林贝尔，LX600）、电泳槽（北京君意，JY-SPCT）、凝胶成像仪（Bio-rad，GelDoc/ChemiDocuniversal hood II）、分光光度计（天根，OSE-260-01）。
无缝克隆的原理
无缝克隆的基本原理1. 介绍无缝克隆（seamless cloning）是一种图像处理技术，用于将源图像的一部分无缝地叠加到目标图像中，使其看起来像是原本就存在的一部分。
这种技术常用于图像修复、风格迁移、图像合成等应用中，能够产生非常逼真的效果。
无缝克隆的基本原理是通过计算图像的梯度信息来实现的。
梯度表示图像的颜色强度变化率，是图像中最容易引起人眼注意的信息之一。
通过控制源图像和目标图像的梯度一致性，在源图像和目标图像的边界处产生平滑的过渡，从而使得两者的拼接看起来无缝连接。
2. 梯度计算在进行无缝克隆之前，首先需要计算源图像和目标图像的梯度信息。
通常使用梯度算子（如Sobel算子）来对图像进行卷积运算，以获取梯度信息。
梯度算子会计算每个像素点周围像素的颜色强度差异，从而得到一个梯度向量。
梯度向量的大小和方向可以通过计算各个方向上的梯度值来表示。
3. 选取源和目标区域在进行无缝克隆之前，需要在目标图像中选取一个目标区域，并在源图像中选取一个对应的源区域。
目标区域是我们希望将源区域无缝叠加到的位置，源区域是我们希望复制到目标图像中的区域。
4. Alpha混合Alpha混合是无缝克隆的核心步骤，用于将源区域与目标区域进行融合。
Alpha通道代表对应像素的透明度，取值范围为0到1，其中0表示完全透明，1表示完全不透明。
通过调整Alpha通道的值，可以实现像素的透明与不透明之间的过渡。
在进行Alpha混合时，需要根据源区域和目标区域的梯度信息来调整Alpha通道的值。
具体方法是将目标区域中每个像素的Alpha通道取值与源区域中对应像素的Alpha通道取值进行加权平均。
权重的计算根据源像素与目标像素之间的梯度差异来决定，梯度差异越小，权重越大，反之权重越小。
5. 感兴趣区域（ROI）感兴趣区域是指图像中特定部分的区域，通常是在进行图像处理时所关注的区域。
在无缝克隆中，感兴趣区域是指目标区域和源区域的边界。
ClonExpress
使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目 录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。
clonepix工作原理
clonepix工作原理
Clonepix是一种图像克隆工具，它的工作原理可以简单概括为
以下几个步骤：
1. 图像分析，首先，Clonepix会对输入的图像进行分析，提
取出图像中的关键特征和结构信息。
这些特征可以包括边缘、纹理、颜色等。
2. 特征匹配，接下来，Clonepix会在图像中寻找与输入图像
中的特征相似的区域。
它使用的是一种叫做特征匹配的算法，通过
比较特征之间的相似度来找到最佳匹配。
3. 像素复制，一旦找到了最佳匹配的区域，Clonepix会将该
区域中的像素复制到目标图像中。
它会根据特征的位置和形状来调
整像素的位置和颜色，以确保复制的像素能够与目标图像中的其他
部分融合自然。
4. 平滑处理，为了进一步提高复制结果的质量，Clonepix还
会对复制的像素进行平滑处理。
这可以包括使用滤波器来减少噪声、调整亮度和对比度等。
总的来说，Clonepix利用图像分析和特征匹配的技术，将输入图像中的特征复制到目标图像中，从而实现图像克隆的效果。
它可以用于多种应用，如图像修复、图像合成等。
无缝克隆技术的原理文献
无缝克隆技术的原理文献
无缝克隆技术（Seamless Cloning）是一种先进的基因克隆技术，其原理基于同源重组。
该技术利用同源序列将外源DNA片段精确地插入到载体DNA的特定位置，实现无缝拼接。
在无缝克隆过程中，首先需要构建一个含有目标DNA片段的载体，该载体通常是一个具有同源臂的质粒或噬菌体。
同源臂是位于载体DNA两端与目标DNA片段具有相同或相似碱基序列的DNA片段，其长度通常在几十到几百碱基对之间。
然后，将目标DNA片段与载体DNA在体外进行同源重组，生成重组DNA分子。
同源重组的效率取决于同源臂的长度、互补性以及是否存在促进重组的酶。
如果同源臂的长度足够长且互补性好，同源重组的效率就会很高。
最后，将重组DNA分子导入到宿主细胞中，并在宿主细胞内进行筛选和扩增，最终获得含有目标DNA片段的无缝克隆。
无缝克隆技术的优点在于其高效率和精确性，可以避免传统基因克隆方法中可能出现的错配和突变等问题。
此外，该技术还可以用于定点突变、基因敲除和基因敲入等基因编辑操作，因此在基因工程、基因治疗和合成生物学等领域具有广泛的应用前景。
请注意，无缝克隆技术需要精确的设计和操作，以确保同源臂的正确匹配和重组的成功。
此外，由于该技术涉及到基因操作，因此需要遵守相关的伦理和法规规定。
基因克隆的几种常用方法
基因克隆的几种常用方法DNA实验 2009-11-18 12:03:11 阅读119 评论0字号：大中小订阅基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。
获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。
现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。
目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
目前,以Genbank的应用最频繁。
这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。
要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。
值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。
ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
环状质粒 扩增特异 PCR制备 有明显非特异性 扩增 预线性化质粒、 基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２ 线性化克隆载体制备 选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列 且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
clonexpressmultis多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
ClonExpressTM MultiS
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Lt/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
ClonExpressTM MultiS试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl，需要时可进行阳性对照 反应，每次反应各加1 μl。 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡
产品概要 产品组成 贮藏条件 实验方案 参考实例 注意事项 常见问题与解决方案
-DNA定点突变
２／产品组成
组 分
5 × CE MultiS Buffer ExnaseTM MultiS pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl) Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)
第五章第五节基因克隆技术教学教材
5’ RACE
巢式PCR（nest PCR）：是指利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩 增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能 性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 。
所有具有某种表现型的基因都可以通过该方 法克隆得到。
通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某 个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密 连锁的RFLP或RAPD分子标记。
通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交 探针的分析，找出与目的基因距离最近的分 子标记，通过染色体步移法将位于这两个标 记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基 因功能互作原理鉴定目的基因。
染色体步移法克隆基因示意图
在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来 计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。 人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥菜中 ，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。
用图位克 隆法获得 水稻脆杆 基因BC1
A. 将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分 子标记C524a和RM16之间；
是由Frohman等(1988)发明的一项技术。是通过PCR进行cDN息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过 往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。
一般分5’ RACE和3’RACE两种： 3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据 一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计) 和PolyT引物PCR即可。 5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)， 根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩 增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。
编程克隆知识点总结
编程克隆知识点总结在本文中，我们将对编程克隆进行详细的知识点总结，包括编程克隆的定义、类型、检测方法、管理原则和未来趋势等方面，以帮助读者更全面地了解和掌握编程克隆相关知识。
一、编程克隆的定义编程克隆是指在软件开发过程中，通过复制和粘贴已有的一段代码来创建新的代码。
克隆代码通常包括两种形式：完全克隆（Exact Clones）和改变克隆（Changed Clones）。
完全克隆是指完全一样的代码片段，而改变克隆是指在完全克隆的基础上进行了一定的修改。
二、编程克隆的类型1. 语法克隆（Syntactic Clones）：语法克隆是指在语法上完全一样的代码片段，但语义可能并不相同。
这种克隆类型通常出现在复制粘贴代码的情况下，往往是由于开发人员快速复制粘贴导致的。
2. 语义克隆（Semantic Clones）：语义克隆是指在语义上相似但在语法上并不相同的代码片段。
这种克隆类型通常出现在复制粘贴后对代码进行一定程度的修改后的情况。
三、编程克隆的检测方法检测编程克隆是软件工程研究的重要问题，通常有以下几种方法：1. 基于文本比对的方法：该方法通过文本比对算法（如编辑距离算法、特征向量算法等）来比对代码文件，从而识别出相似的代码片段。
2. 基于语法树的方法：该方法将代码片段转换成语法树表示，然后通过比对语法树的方法来检测克隆代码。
3. 基于标记的方法：该方法通过给代码片段打上标记（如哈希值、标签等）来表示其特征，并通过比对标记的方式来检测克隆代码。
4. 基于度量的方法：该方法通过一些代码度量指标（如代码长度、分支数、循环数等）来度量代码片段的相似性，从而检测克隆代码。
以上四种方法各有优缺点，应根据实际情况选择合适的方法来进行编程克隆的检测。
四、编程克隆的管理原则1. 避免盲目克隆：开发人员在编程过程中应避免盲目克隆他人代码，应该根据实际需求进行合理的抽象和封装，提高代码的可复用性。
2. 使用克隆检测工具：开发团队可以使用一些克隆检测工具来帮助识别潜在的克隆代码，从而及时采取措施进行管理和优化。
新克隆技术不用酶切位点,直接克隆
Murine IgG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR Product Sense 5′-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3′ Antisense (SalI underlined) 5′-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3′
x μl**
dH2O μTol tal Volume
x 10 μl
Linearized vector : Purified PCR fragment(摩尔比)=1:2 *<0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng **<10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng
29 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
•
In-Fusion®应用文献
1. Comparative Epigenomic Analysis of Murine and Human Adipogenesis
Tarjei S. Mikkelsen, Zhao Xu, et al. Cell, Oct 2010 ; 143 : 156–169
In-Fusion 克隆技术介绍
宝日医生物技术（北京）有限公司
September 24, 2020
无缝克隆技术原理
无缝克隆技术原理
无缝克隆技术原理. 基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的。
. 唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
. 通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化。
.
中文名: 无缝克隆
外文名: Seamless Cloning/In-Fusion Cloning
特点: 依靠自身酶系将缺口修复
类型: 克隆方法。
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ClonExpressTM MultiS试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl，需要时可进行阳性对照 反应，每次反应各加1 μl。 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡
注意: 1. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围 时，直接选择最低/最高使用量即可。 2. 插入片段DNA使用量应大于10 ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用 10 ng即可。 3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体 积的1/5，即4 μl。
40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。 克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。 A 线性化克隆载体由酶切制备
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首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插 入片段)，如图二所示
其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的 同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物 中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段 (第一片段)的反向扩增 引物中为例，引物具体设计方案如图三所示：
ClonExpressTM MultiS
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Ltd
网站/Web: 咨询热线/Tel: 400-600-9335 销售/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物 退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
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PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。 ClonExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不 是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需 纯化直接用于重组反应。 PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都 会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量 的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方 式可查阅表二。
４．６ 反应产物转化、涂板 取20 μl冷却的反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃摇菌45 min。取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将 平板倒置，于37℃过夜培养。
４／实验方案
４．１ 实验流程概览（图一） 1).线性化克隆载体制备 (参见4.2)； 2).插入片段扩增引物设计 (参见4.3)； 3).插入片段PCR扩增 (参见4.4)； 4).进行重组反应 (参见4.5)； 5).反应产物转化、涂板 (参见4.6)； 6).克隆鉴定 (参见4.7)。 B
ClonExpressTM MultiS 重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产 物加热失活内切酶 (参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活) 后可直接用于重组反应。 线性化克隆载体由反向PCR扩增制备 我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase, Vazyme, P501) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线 性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。 CloneExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预 线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。 克隆载体酶切产物或 PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接 使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提 高 DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体) 。不 同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左 右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
扩增特异
胶回收
有明显非特异性扩增
表二：扩增产物推荐使用方式 注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5)。 * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活， 以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
４．３ 插入片段扩增引物设计 ClonExpressTM MultiS 引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入同源重组序列，使得扩 增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序 列 (15 bp～20 bp)。以pUC18作为克隆载体、进行三插入片段顺序拼接克隆 (5’至3’按克 隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段)为例，引物具体设计方案如下：
C113-01 (10 rxn)
40 μl 20 μl 5 μl 5 μl
C113-02 (25 rxn)
100 μl 50 μl 5 μl 5 μl
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３／贮藏条件
本产品应置于-20℃储存。
双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。 单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
PCR扩增情况
PCR模板类型 与克隆载体抗性相同 的环状质粒 预线性化质粒、 基因组、cDNA
快速实验方案 DpnI 消化后直接使用* 直接使用 胶回收
最佳实验方案 胶回收或DpnI 消化后胶回收
或者涡旋混匀)。置于37℃反应30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
注：ClonExpressTM MultiS 重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使 是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克 隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备 线性化克隆载体。
Vazyme biotech co., ltd.
使用说明书
Version 3.2
目 录 Catalog
１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和 线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端 序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应 30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM MultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重 组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTM MultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多 至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTM MultiS还兼容常规酶切、PCR反应体 系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于 重组克隆，极大的简化了实验步骤。 产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆 应用范围 -多片段拼接克隆 -全基因合成
产品概要 产品组成 贮藏条件 实验方案 参考实例 注意事项品组成
组 分
5 × CE MultiS Buffer ExnaseTM MultiS pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl) Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)
TM
环状质粒 扩增特异 PCR制备 有明显非特异性 扩增 预线性化质粒、 基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２ 线性化克隆载体制备 选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列 且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
图三：第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温 度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。