DNA片段的克隆及常见的问题

TA克隆载体简介 TA克隆载体简介
新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 PCR
pCF-T：TA快速克隆载体 ： 快速克隆载体 pCF-Blunt：多克隆位点为平端，不带T，，其他序列与pCF-T 相 ：多克隆位点为平端，不带 ，，其他序列与 ，，其他序列与 适合平末端DNA片段快速连接 同，适合平末端 片段快速连接
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
TA克隆的流程 克隆的流程
I.高纯度的基因资源
杂交筛选或PCR扩增目的基因 II.杂交筛选或 扩增目的基因
III.目的基因的纯化 III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、 IV.目的基因与T载体的连接、转化 目的基因与 V.目的基因的筛选及鉴定 V.
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根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA 根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA Marker的量及其荧光的强弱 样品进行定量。 样品进行定量。 使用此法还有一个突出优点， 使用此法还有一个突出优点，即它可令操作者直观地获 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 DNA样品的完整性及其大小
反应体系 目的PCR 片段 目的 对照插入片段（ 对照插入片段（700 bp, 50 ng/µl） ） pBS-T载体 载体 Ligase 10×Ligation Buffer × 无菌去离子水 2 – 7 µl —— 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl 阳性对照 —— 1 µl 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl
重组质粒筛选简介 重组质粒筛选的方法
根据重组载体的 标志筛选 PCR法筛选 酶切法筛选 测序筛选 抗氨苄青霉素，抗卡那霉素、lacZ基因 用特定引物以转化细胞为模板扩增目的序列 酶切比较载体限制酶内切图谱的变化 一般都会用测序对目的序列做最后鉴定
DNA定量分析－分光光度法 定量分析
分光光度法： 分光光度法：
常见问题分析
问题二：相对对照组， 问题二：相对对照组，实验组白色菌落很少或者 根本没有。 根本没有。
DNA定量分析－分光光度法响OD值准确性的因素： OD值准确性的因素
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溶解核酸的缓冲液的pH值 离子强度（建议使用缓冲液， TE）； 溶解核酸的缓冲液的pH值、离子强度（建议使用缓冲液，如TE）； pH 样品的稀释浓度。 样品的稀释浓度。样品中不可避免存在一些细小干扰测试效果的颗粒 所以样品的浓度不能过低，也不能过高。吸光值最好在0.1-1.5A之间； 所以样品的浓度不能过低，也不能过高。吸光值最好在0.1-1.5A之间； 0.1 之间 核酸本身物化性质（片段长短不一、存在二级结构等）； 核酸本身物化性质（片段长短不一、存在二级结构等）； 仪器本身有一定的准确度和精确度 ； 操作因素：混合要充分、混合液不能存在气泡、空白液无悬浮物、 操作因素：混合要充分、混合液不能存在气泡、空白液无悬浮物、使 用相同的比色杯测试空白液和样品、不能采用窗口磨损的比色杯、 用相同的比色杯测试空白液和样品、不能采用窗口磨损的比色杯、样 品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等
DNA克隆的操作步骤 DNA克隆的操作步骤
f. . 已转化的感受态细胞转移到上述平板上， 将100-300 μl 已转化的感受态细胞转移到上述平板上，轻轻 100的将细胞均匀涂开。 的将细胞均匀涂开。
将平板置于室温直至液体被吸收。 g. 将平板置于室温直至液体被吸收。 h. 倒置平板，于37℃培养12—16小时。 挑选白色菌落检测。 倒置平板， 37℃培养12 16小时。 挑选白色菌落检测。 培养12 16小时
DNA克隆常见问题分析及解决方案 DNA克隆常见问题分析及解决方案
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
连接克隆化学原理 连接克隆化学原理 连接反应
连接克隆分类 PCR产物克隆为例 产物克隆为例） 连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）
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DNA纯品的OD 1.8，故根据OD DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260 /OD280的值可以估计 纯品的 DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA， DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋 的纯度 RNA 白质存在。 的比值应在0.4 0.5之间 0.4之间， 白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说 明有残余的盐存在。 明有残余的盐存在。
c. 混合均匀，室温静置0.5-1小时，或4℃放置过夜。 混合均匀，室温静置0.5- 小时 0.5 小时， ℃放置过夜。 d. 取5 µl连接产物转化感受态细胞 连接产物转化感受态细胞
DNA克隆的操作步骤 DNA克隆的操作步骤 2. 转化
取一管感受态细胞，置于冰浴中，待溶化后用冰预冷的枪头吸取30-50 µl a. 取一管感受态细胞，置于冰浴中，待溶化后用冰预冷的枪头吸取 到一个新的预冷的无菌离心管中，加入连接产物2-5 µl，轻轻旋转以混匀 到一个新的预冷的无菌离心管中，加入连接产物 ， 内容物，在冰中放置20 分钟。（如需加入较多量的DNA，可加大感 内容物，在冰中放置 - 30分钟。（如需加入较多量的 分钟。（如需加入较多量的 ， 受态细胞用量。） 受态细胞用量。） 将管放在室温（25℃左右 10分钟左右 或者放到42℃ 左右） 分钟左右， 42℃循环水浴中放置 b. 将管放在室温（25℃左右）10分钟左右，或者放到42℃循环水浴中放置 60-90秒 不要摇动。 60-90秒，不要摇动。 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 分钟。 c. 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。 每管加500 SOC培养基或LB培养基 培养基或LB培养基， 置于37℃摇床振摇培养， 37℃摇床振摇培养 d. 每管加500 μl SOC培养基或LB培养基， 置于37℃摇床振摇培养，转速 rpm，温育45分钟使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗性基因。 45分钟使细菌复苏 180 rpm，温育45分钟使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗性基因。 e. 准备含50μg/ml氨苄青霉素的SOB或LB琼脂培养基平板 氨苄青霉素的SOB 琼脂培养基平板， 准备含50-100 μg/ml氨苄青霉素的SOB或LB琼脂培养基平板，加40 μl 50 Gal（ mg/ml的浓度溶于二甲基甲酰胺中），用一无菌的弯头玻棒 的浓度溶于二甲基甲酰胺中）， X-Gal（以20 mg/ml的浓度溶于二甲基甲酰胺中），用一无菌的弯头玻棒 涂布均匀。TOP10菌株转化后 理论上加不加IPTG 菌株转化后， IPTG都应出现同样的蓝白斑 涂布均匀。TOP10菌株转化后，理论上加不加IPTG都应出现同样的蓝白斑 效果，但若效果不明显，也可加入16 IPTG（50mg/ml） Gal一起 效果，但若效果不明显，也可加入16 μl IPTG（50mg/ml）与X-Gal一起 涂布平板后再涂布菌体。 涂布平板后再涂布菌体。
DNA克隆的操作步骤 DNA克隆的操作步骤 连接（ 为例） 1. 连接（以pBS-T载体 为例）
离心装有载体和酶的离心管，以免液体挂在管壁上，导致体积不够。 a. 离心装有载体和酶的离心管，以免液体挂在管壁上，导致体积不够。 将反应体系加入0.5 离心管 具体加量如下： 离心管， b. 将反应体系加入 ml离心管，具体加量如下：
酶切连接克隆
PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切 PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切 引物设计时引入载体上的酶切位点 后定向克隆到目的载体上。 后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克 筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难， PCR产物的酶切和判断比较困难 隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难， 另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。 另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
常见问题分析
问题一： 问题一：转化后无克隆产生
原 因
1. 2. 3.
1. 2.
感受态细胞低效 抗生素使用错误 转化后立即涂板 忘记温浴
对 策
3.
使用高效率的感受 态细胞（106以上） 复查质粒抗性，使 用正确的抗生素 转化后温浴45min左 右，让抗性基因得 以表达
DNA定量分析－ Marker定量法 定量分析 定量法
Marker定量法 Marker定量法 ：
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DNA的紫外检测通常使用荧光染料溴化乙锭， DNA的紫外检测通常使用荧光染料溴化乙锭，该物质含 的紫外检测通常使用荧光染料溴化乙锭 有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的平面基团， 有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的平面基团，这个 DNA的堆积碱基之间的平面基团 基团的固定位置及其与碱基的密切接近， 基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与 DNA结合并呈现荧光。 DNA结合并呈现荧光。 结合并呈现荧光
3. 检测
常规检测：得到的白色菌落接种LB（ a. 常规检测：得到的白色菌落接种 （50-100 µg/ml氨苄青霉 氨苄青霉 培养基， ℃摇床振摇培养，提取质粒， 素）培养基，37℃摇床振摇培养，提取质粒，由PCR方法或 方法或 酶切方法鉴定插入片段是否正确。 酶切方法鉴定插入片段是否正确。 快速检测：得到的白色菌落或经过培养后的菌体直接进行PCR b. 快速检测：得到的白色菌落或经过培养后的菌体直接进行PCR 检测。 检测。
感受态细胞简介
感受态效率定义
每微克DNA产生的菌落数 每微克DNA产生的菌落数 DNA 普通的亚克隆实验保存，避免反复冻融 70℃保存， 保存
常用感受态细胞的菌株
TOP10；DH5a ； BL21(DE3）； ）；BL21(DE3) plysS ）；
TA克隆 TA克隆
是目前广泛使用的一种借用中间载体的非定向克隆方法。 是目前广泛使用的一种借用中间载体的非定向克隆方法。由于 普通Taq酶扩增得到的PCR产物带有A末端，可以用带有T Taq酶扩增得到的PCR产物带有 普通Taq酶扩增得到的PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突 出的T载体直接连接。这个方法比较简便，不需要经过双酶切， 出的T载体直接连接。这个方法比较简便，不需要经过双酶切， 对引物设计也没有要求。 对引物设计也没有要求。
TA克隆载体简介 TA克隆载体简介
特点
载体3’端的 与 产物3‘端的 互补连接， 载体 端的T与PCR产物 端的 互补连接， 同时 突出端可防止载 端的 产物 端的A互补连接 同时3’突出端可防止载 体自身环化，大大提高PCR产物的连接和克隆效率 体自身环化，大大提高 产物的连接和克隆效率 二者区别： 二者区别：多克隆区域的酶切位点不同
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DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰， DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰， 处有最大吸收峰 280nm处有最大的吸收峰 盐和小分子则集中在230nm处 因此，可以用260nm波长进行分 盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分 230nm 260nm 光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml的dsDNA， 光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml的dsDNA， DNA浓度 值为 50μg/ml 37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Oligo。 37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Oligo。